כרומטוגרפיה
מתוך ויקיפדיה, האנציקלופדיה החופשית
 |
ערך זה זקוק לעריכה, על מנת שיתאים לסגנון המקובל בוויקיפדיה. לצורך זה ייתכנו סיבות אחדות: פגמים טכניים כגון מיעוט קישורים פנימיים, סגנון הטעון שיפור או צורך בהגהה. אם אתם סבורים כי אין בדף בעיה, ניתן לציין זאת בדף השיחה שלו. |
כרוֹמטוֹגרפיה (באנגלית: Chromatography) היא שיטה בכימיה אנליטית המאפשרת הפרדה של חומרים המצויים בתערובת, זיהויים וקביעת כמוּתם. בנוסף לשימושים המדעיים הרבים שיש לכרומטוגרפיה בכימיה ובביולוגיה, ניתן לפגוש בה רבות בתחום הזיהוי הפלילי, בתעשיית המזון, בתעשיית התרופות ובבתי חולים.
תוכן עניינים |
[עריכה] עקרון
לסוגי הכרומטוגרפיה הרבים עקרון פעולה משותף. התערובת שאותה רוצים להפריד מומסת בנוזל או בגז (או שהיא בעצמה נוזל או גז); בחלק מסוגי הכרומטוגרפיה מוזרם הנוזל או הגז (המכונה פאזה נעה או ניידת) בצינור או שפופרת שדפנותיו הפנימיות מצופות במוצק או ג'ל (המכונה פאזה נחה או נייחת); לעתים ממלאת הפאזה הנחה את הצינור כולו. בסוגי כרומטוגרפיה אחרים את הצינור מחליף משטח (נייר, פלסטיק או אחר) המהווה את הפאזה הנחה, והפאזה הנעה נודדת על גביו.
בין שתי הפאזות נוצרות אינטראקציות כימיות (לא תגובות כימיות). בדרך-כלל מדובר במשיכות חשמליות הנובעות מההבדלים בקוטביות של החומרים השונים המעורבים. לעתים מדובר בהבדלים במסיסות או בכושר ההיספגות של החומרים השונים. היות שחוזקן של האינטראקציות בין הפאזה הנחה ובין המרכיבים השונים של הפאזה הנעה שונה ממרכיב למרכיב, זורם חלק מהמרכיבים במהירות לקצה הצינור או הנייר, ואילו חלק אחר זורם באיטיות. כך מופרדת התערובת למרכיביה.
את התוצאות ניתן לראות בשלושה אופנים:
- בסוגי כרומטוגרפיה פשוטים, בהם ההפרדה נעשית על נייר או משטח אחר, ניתן לראות בעין את החומרים שהופרדו מהתערובת, בתנאי שהם בעלי צבע.
- אם הם חסרי צבע, ניתן להוסיף שיירים אולטרה-סגולים לתערובת, לפני ההפרדה, ולאחר מכן לחשוף את הנייר לאור אולטרה סגול (UV). ניתן, כשיטה נוספת, להוסיף פיגמנטים שונים הצובעים את מרכיבי התערובת.
- בסוגי כרומטוגרפיה מתקדמים, בהם ההפרדה נעשית בצינור, קיימים גלאים אלקטרוניים משוכללים בקצה הצינור. הללו מזהים את החומרים, לפי סדר הגעתם, ומתרגמים (בעזרת מעבד) את הנתונים לשם הצגתם באופן גרפי (על גבי צג או כהדפס).
[עריכה] היסטוריה
מקור המילה כרומטוגרפיה ביוונית: כרומה פירושו "צבע", גרפיה פירושו "כתיבה". נראה כי אין קשר רב בין פירוש המילה לבין השיטה עצמה; ואכן, השם הוענק לשיטה על ידי ממציאה, הבוטנאי הרוסי מיכאיל צבט, והיא מתייחסת ראשית לשמו (צבט ברוסית פירושו "צבע") ושנית לחומר שביקש לבודד בנסיונותיו הראשונים: הפיגמנט כלורופיל, המקנה לצמחים את צבעם הירוק.
צבט פיתח את השיטה בשנת 1901, למרות שעקרונותיה היו ידועים עוד לפני כן; תרומתו של צבט הייתה ביישום העקרונות לשימוש מעשי. צבט לא הצליח לפרסם את שיטתו במידה רבה, אולי כיוון שכתב את עבודותיו רק ברוסית. במהלך המאה ה-20 התפתחה הכרומטוגרפיה בצעדים משמעותיים; ב-1952 זכו שני בריטים בפרס נובל לכימיה על פיתוח תאוריות מתקדמות וכמה סוגים של כרומטוגרפיה.
[עריכה] שיטות כרומטוגרפיות על-גבי משטח
[עריכה] כרומטוגרפיית נייר
בשיטה פשוטה זו הפאזה הנחה היא רצועת נייר (העשוי ברובו מתאית), שבמרכזה מניחים טיפה מהתערובת שרוצים להפריד (יש לוודא שאף אחד ממרכיביה לא עלול להגיב עם הנייר). הנייר מוטבל בקצהו אל תוך הפאזה הנעה - מים או אתנול, למשל. הפאזה הנעה מתחילה "לטפס" במעלה הנייר; כשהיא פוגשת את טיפת התערובת היא גוררת את מרכיביה איתה. עתה מתבצעת ההפרדה: מרכיבי התערובת שאינם יוצרים אינטראקציות חזקות עם מולקולות הנייר מטפסים במהירות עם הפאזה הנעה אל קצה הנייר; המרכיבים שיוצרים אינטראקציות עם הנייר מזדחלים באיטיות. התוצאה המתקבלת היא שורה של נקודות, כל אחת מייצגת אחד ממרכיבי התערובת.
את התוצאות ניתן להשוות לתוצאות ידועות של החומרים המדוברים. ניתן לחשב את שיעור הנדידה של כל חומר, ולהשוות עם ערכים ידועים הכתובים בספרות. שיעור הנדידה (מסומן RF) שווה למרחק שנדד החומר (2 ס"מ, לדוגמה) חלקֵי המרחק שנדדה הפאזה הנעה (5 ס"מ, למשל; במקרה זה שווה ה-RF ל-0.4).
בכרומטוגרפיית נייר דו-ממדית מסובבים את הנייר באמצע התהליך ב-90 מעלות. כתוצאה מכך נוצרת הפרדה כפולה, מדויקת יותר; זו משמשת בדרך-כלל להפרדת תערובות בעלות מספר רב של מרכיבים דומים מאוד.
[עריכה] כרומטוגרפיית שכבה דקה
שיטה זו, הידועה יותר כ-TLC (באנגלית: Thin Layer Chromatography), זהה לכרומטוגרפיית נייר, אלא שכאן הפאזה היא משטח (זכוכית, נייר אלומיניום או פלסטיק) המצופה חומר סופג (סיליקה, אלומינה או תאית, למשל). השיטה מהירה ומדויקת יותר מכרומטוגרפיית נייר, והיא משמשת רבות בכימיה אורגנית.
[עריכה] שיטות כרומטוגרפיות בעמודה
[עריכה] כרומטוגרפיית גודל המולקולה
הפרדה לפי משקל מולקולארי או הפרדה לפי גודל מולקולה Size Exclusion Chromatography -SEC
כרומוטוגרפיה סינון בג'ל, או SEC היא שיטה להפרדת חלקיקים לפי גודלם או ליתר דיוק נפחם בממס מסוים. לרב שימושיה הן טהור ואנליזה של מולקולות סינתטיות וביולוגיות כמו: חלבונים, פוליסוכרים וחומצות גרעין. ביולוגים וכימאים משתמשים בתמיסה ג'לטינית שמורכבת מחרוזים קטנים בעלי חריצים המרכיבים את הפזה הנייחת, דרכה תעבור תמיסה הבופר ובה החלקיקים המיועדים להפרדה. יתרונה של השיטה הוא בכך שניתן להשתמש במגוון גדול של תמיסות מבלי שהן יפגעו בתהליך הסינון ולא יפגעו בפעילות הביוכימית של המולקולות המיועדות להפרדה. לרב לא די רק בשיטה זאת להפרדה מושלמת ולכן היא משמשת כאחד השלבים מני רבים (כרומטוגרפיית זיקה ,כרומוטוגרפיה לפי מטען וכו').
[עריכה] תאוריה ושיטות:
ישנן שתי הנחות בסיסיות שמניחים בשיטת SEC. (יש לשים לב שהן לא תמיד מתקיימות).
1. ככל שהמולקולה ארוכה (גדולה) כך גם משקלה המולקולארי יהיה גדול יותר (לדוגמה: נהוג להניח כי משקלה של חומצה אמינית אחת הוא כ-110 KDa)
2. המולקולות איתן נעבוד מתקפלות לאותו מבנה מרחבי עגול (לדוגמה: החלבונים נמצאים במבנה השלישוני או הרבעוני שלהם).
אם לחבר את שתי ההנחות, אז העיקרון המנחה הוא שמולקולות בגדלים שונים יצאו בנפחי אילוציה שונים (אילוציה היא התמיסה שנאספת בתחתית עמודת ההפרדה ובה החלקיקים שעברו סינון). ההפרדה מתבצעת בתוך עמודת הפרדה (Column או קולונה) שמורכבת מצינור חלול ובתוכו ארוזים חרוזים מחוררים (נקראים בידיים - bead) עשויים פולימר(לרב Dextran,Agaros או מפוליאקרילאמיד (Polyacrylamid)). הבידים מעוצבים בגדלים שונים ויוצרים תעלות דרכם החלקיקים (המתאימים בגודל) יוכלו לנוע, כלומר החלקיקים נעים בתוך הקולונה בנוזל הבופר כאשר בהתאם לגודלם היחסי חלקם נכנסים גם לחריצים של הבידים וחלקם ממשיכים עם הנוזל אל קצה הקולונה. ככל שהחלקיק גדול יותר כך הנפח בו הוא יוכל לנוע בתוך הקולונה קטן יותר ולכן חלקיק גדול יצא בנפח אילוציה קטן יותר.
[עריכה] גורמים המשפיעים על הסינון
- גודל החלקיקים המסוננים וחריצי הבידים: במצב אמת החלקיקים וחריצי הבידים אינם מתואמים באופן מושלם לצפיותינו, התמיסה מורכבת מחלקיקים בגדלים שונים ולפעמים חלקיק שמתאים בגודלו לחריץ לא יכנס אליו, ובכך יקצר את דרכו החוצה. בדיוק בגלל הסיבה הזאת נפח האלוציה מתפלג נורמלית.
- שינויים בקולונה: ניתן להשפיע על איכות ההפרדה על ידי הארכת הקולונה או על ידי הגדלת צפיפות הבידים, שינויים כאלה יעלו את רזולוציית ההפרדה . מצד שני צפיפות ייתר עלולה לגרום לסתימת הקולונה ובכך לפגוע בפעילותה. דרך נוספת להגדלת יכולת ההפרדה היא תוספת של בידיים בגדלים שונים (או אם לדייק, הוספת בידיים בעלי מגוון רחב של חריצים), כלומר יצירת מצב בו גם למולקולות בגדלי הביניים ישנם בידיים בהן הן יכולות לנוע ו"להתעקב" בתוך הקולונה.
[עריכה] לסיכום
השיטה היא המסת חומר בממס מסוים והנעתו בתוך קולונה על ידי ממס (בופר) נוסף דרך שכבה נייחת (בידים) לשם הפרדתו לפי גודל, כאשר לפי נפח הממס המניעה שיצא (אילוציה), מחליטים על גודל המולקולה.
הפרדה לפי משקל (SEC) היא שיטה שנועדה להבדיל בין מולקולות כתלות בגודלם במרחב, וזאת מבלי לפגוע בפעילותם תוך כדי הסינון. לרב נשתמש במס' שיטות כדי להפריד בין חלקיקים בתוך תמיסה כאשר SEC תהייה אחת מהן.
[עריכה] כרומטוגרפיית זיקה
בשיטה זו, הידועה גם ככרומטוגרפיית אפיניות (באנגלית: Affinity Chromatography) והמשמשת בעיקר להפרדת חלבונים, משתמשים באינטרקציות ביולוגיות ספציפיות (לא קוולנטיות). דוגמאות לאנטרקציות כאלו הן: אנזים ו-סובסטראט, קולטן ו-ליגנד וכו'.השיטה הזאת דומה לשיטת SEC, כאשר גם פה ישנה עמודה (Column - קולונה) שמורכבת מפאזה נייחת, רק שבמקרה זה אל הבידים קשורה קוולנטית מולקולה, שזיקתו אליה של אחד החומרים המועמסים לקולונה גבוה. את הפאזה הנעה, נוזל המכיל את התערובת, מוזגים אל הפתח העליון של העמודה. התערובת מחלחלת לאיטה דרך העמודה, כשמרכיביה נודדים במהירויות שונות, עד שהיא מגיעה לתחתית, בשלב זה החומר אותו נרצה לבודד יהיה קשור לפאזה הנייחת (ליתר דיוק לליגנד) בצורה הפיכה ויתר המולקולות שהועמסו לקולונה ישטפו על ידי נוזל הבופר. כשמבצעים כרומטוגרפיית אפיניות, יש לדעת מראש אילו חלבונים מצויים בתערובת, ולבחור את הליגנד בהתאם.
[עריכה] תאוריה ושיטות
כאשר אנחנו רוצים להפריד על ידי קולונת אופיניות חשוב לקחת מס' דברים בחשבון.
1. מולקולת המטרה (לרב חלבון) תהייה בעלת תכונה ידועה ומוגדרת, אותה נוכל לנצל לטובת ההפרדה (לדוגמה: Concanavalin A שהוא חלבון בעל זיקה גבוה לגלוקוז).
2.הקישור של מולקולת המטרה לליגנד היא ספציפית מאוד ורב המולקולות לא יקשרו אליו.
3.הקשר בין מולקולת המטרה לליגנד הוא לא קשר קוולנטי ולכן ניתן להתחרות בו. (לדוגמה: הוספת גלוקוז חופשי כדי לבודד את הConcanavalin A מהקולונה).
אם לחבר את שלושת הקוים המנחים, אז כדי לבודד חלבון מסוים על ידי קולונת אפיניות צריך להכיר את החלבון אותו אנחנו מבקשים לבודד. לפי הידע המוקדם שלנו נקשור בצורה, קוולנטית, אל הבידים מולקולה אליה לחלבון המטרה אפיניות גבוהה. את הבידים נעמיס אל הקולונה והם יהוו את הפאזה הנייחת. בהמשך נעמיס לתוך הקולונה תמיסה ובה החלבון אותו אנחנו מבקשים לבודד, לאחר מכן נזרים תמיסת בופר שתשטוף את יתר החלבונים שלא נקשרו מהקולונה. בשלב הבא נזרים לתוך הקולונה את אותה המולקולה שקשרה את החלבון לבידים, והיא תתחרה על הקישור לחלבון, כלומר בריכוז גבוה החלבון יקשר אליה וכל שנשאר לעשות הוא לאסוף את האילוציה מתחתית הקולונה.
[עריכה] שימושים
1.בידוד מולקולות מתערובת מבלי לפגוע בתיפקודם הביולוגי/כימי.
2. דילול בריכוז חומר מסוים מתוך תערובת.
3. גילוי איזה מולקולה ביולוגית נקשרת לחומר מסוים (כמו לתרופות לדוגמה).
[עריכה] כרומטוגרפיית חילוף יונים או הפרדה לפי מטעון
בשיטה זו, הידועה יותר כ-IEC (באנגלית: Ion-Exchnage Chromatography). שיטת IEC מאפשרת הפרדת מולקולות לפי מטענן החשמלי. בשיטה ניתן להפריד כמעט כל סוג של מולקולה טעונה לרבות, חלבונים, חומצות גרעין וחומצות אמיניות. התמיסה המיועדת להפרדה נקראת דוגמית. את הדוגמית מעמיסים לתוך עמודה (קולונה), שהיא בעצם צינור חלול המורכב משכבת ג'ל עשויה חרוזים קטנים (בידים, באנגלית: bead), הבידים קשורים קוולנטית לשיירים טעונים, ומהווים את הפזה הנייחת. הדוגמית מוזרמת דרך הקולונה על ידי תמיסת בופר ונקראת הפזה הניידת. כל תמיסה שתוזרם מחוץ לקולונה על ידי תמיסת הבופר ובה חלק מגורמי ההפרדה תקרא אילוציה.
הפרדה זו מתבססת על כך שלחלבונים מספר גדול של קבוצות פונקציונליות טעונות (חיובית או שלילית) כתלות בחומציות התמיסה בה הם נמצאים. IEC מפרידה בין חלבונים על סמך המטען הכללי על שרשרת הפפטיד, כאשר המטען תלוי בחומציות הפזה הניידת.
IEC מפרידה בין מולקולות על ידי אינטרקציה יונית בין המולקולות הטעונות הנמצאות בפאזה הניידת לבין השיירים הטעונים (R-X) הנמצאים על הבידים (הפאזה הנייחת). השיירים מגיבים עם מולקולות טעונות (במטען הנגדי) מהדוגמית.
ניתן לחלק כרומטוגרפיה מסוג זה לשתי תת קבוצות: כרומטוגרפיית קטיונים וכרמטוגרפיית אניונים. כרומטוגרפיית קטיונים מפרידה בין המולקולות מהדוגמית בעזרת האופי השלילי של השייר על הפאזה הנייחת, כאשר בכרומטוגרפיית אניונים משתמשים בשייר טעון חיובית.
אופי האינטרקציה בין המולקולות יכול להיות מבוקר על ידי pH תמיסת הבופר, כאשר השינוי ב-pH נעשה על ידי הוספה של מלח. ככל שמולקולה טעונה יותר כך ידרשו ריכוזים גבוהים יותר של מלח כדי להזרימה מתוך הקולונה. ניתן לקבל פרופיל אילוציה הדומה ליתר שיטות הכרומטוגרפיה בעמודה, כלומר כדי להזרים חלבון טעון יותר דורש כמות מלחים גבוהה יותר.
[עריכה] דוגמה
תהא דוגמית המכילה את חלבונים א' וב' המתוארים להלן:
| חלבון | מטען כללי ב-pH 7 |
|---|---|
| חלבון א' | + (חיובי) |
| חלבון ב' | - (שלילי) |
הדוגמית תוזרם בנוזל בופר דרך קולונה של כרומוטוגרפיית קטיונים (כלומר אל הבידים שמרכיבים את הפזה הנייחת קשורים שיירים שליליים) חלבון א' בשל מטענו החיובי יקשר בתוך הקולונה לבידים בעלי שיירים שליליים, בזמן שחלבון ב' יזרום מתוך הקולונה עם תמיסת הבופר. ישנן מס' שיטות בהן ניתן להשתמש כדי להזרים את החלבון מחוץ לקולונה:
- הזרמת יונים בעלי מטען זהה למטען החלבון הקשור, בדרך זאת "נמסך" על הפאזה הנייחת. היונים יאפשרו לנו להזרים את החלבון אל מחוץ לקולונה.
- הזרמת יונים בעלי מטען שונה ממטען החלבון הקשור, בכך נייצר גורם תחרותי לשיירים הטעונים של הבידים.
- דרך נוספת לנתק את החלבונים מהבידים היא על ידי הוספת מלחים אשר יבצעו את שני התהליכים שהזכרנו בשני הסעיפים הקודמים במקביל.
- שינויים בחומציות הפזה הניידת יביאו את החלבונים לנקודה האיזואלקטרית, ובכך ישחררו אותם מהפאזה הנייחת.
שחרור המולקולות נעשה על ידי הוספה של גורמים תחרותיים כגון מלחים. פרופיל האילוציה דומה לייתר שיטות ההפרדה בעמודה, כאשר הגורמים המשפיעים הם: כמות המטען על המולקולה אותה מבקשים להפריד מול כמות המלח אותה צריך להמיס כדי לשחרר את החלבון. בשתי התמונות ניתן לראות פרופיל אילוציה של חלבון מסוים כתלות בכמות המלח שהמסנו. בדוגמה 1 החלבון השני מתחיל להשתחרר כאשר לא כל החלבון הראשון יצאה (רואים תחום חפיפה), ובדוגמה 2 החלבון השני יוצאה אחרי שכל החלבון הראשון יצאה (זה מצביעה על הפרש משמעותי בין המטענים).
[עריכה] שיטות כרומטוגרפיות מתקדמות
[עריכה] כרומטוגרפיית גז
בשיטה זו (GC), הפאזה הנעה היא גז (אציל, על-מנת שלא יגיב עם החומרים בתערובת). ההפרדה נעשית בעמודת הפרדה או בנים (Capillary) דק וארוך (אורכו עשוי להגיע ל-100 מטרים). שיטה זו מתאימה רק לחומרים המתאדים או רותחים בטמפרטורות נמוכות יחסית. זיהוי החומרים המופרדים נעשה על ידי גלאים משוכללים, המתרגמים את הנתונים לצורה גרפית.
זמן הנדידה של כל אחד מהחומרים בתערובת - הזמן שעובר עד שהם חוצים את העמודה לאורכה - תלוי בנקודת הרתיחה שלהם, בעיקר, ופחות באינטראקציות עם הפאזה הנחה. לפיכך, השיטה יעילה במיוחד להפרדה של סדרות הומולוגיות - תרכובות אורגניות המשתייכות לאותה משפחה, אך הנבדלים זה מזה באטום פחמן אחד (לדוגמה: האלקאנים מתאן, אתאן, פרופאן, בוטאן). כל אטום פחמן נוסף מגביר את חוזקה של המולקולה, ובכך את נקודת הרתיחה שלה; לכן החומרים מגיעים אל הגלאי לפי סדר גודל המולקולה. ההפרדה ב-GC נעשית במהירות, תוך מספר דקות. אחד מחסרונות השיטה הוא שהתערובת הנבדקת רותחת ונהרסת; אם לא ניתן לוותר עליה, יש להשתמש בשיטה אחרת. חסרון נוסף הוא מחירם של מכשירי ה-GC, המתחיל בעשרות אלפי דולרים.
[עריכה] כרומטוגרפיית נוזל בלחץ גבוה
בשיטה זו, הידועה כ-HPLC (באנגלית: High Pressure Liquid Chromatography), מומסת התערובת בפאזה הנעה (ממס זה או אחר), המוזרק בלחץ גבוה אל עמודה או נים. גם כאן מחכה לחומרים גלאי בקצה העמודה, המתרגם את הנתונים לצורה גרפית. ב-HPLC, אולם, ההפרדה מבוצעת על ידי הבדלים בקוטביות של חומרי התערובת. חומרים קוטביים (הידרופיליים) נמשכים לפאזה הנחה ונשארים זמן רב יותר בעמודה, וחומרים הידרופוביים (שומנים, למשל) ממהרים להגיע לקצה. גם שיטה זו טובה להפרדת סדרות הומולוגיות, שכן כל אטום פחמן נוסף מוריד מקוטביות המולקולה.
ב-HPLC מהופך (Reversed Phase (RP) HPLC) הפאזה הנחה היא הידרופובית, בניגוד ל-HPLC הרגיל, בו היא הידרופילית. לפיכך, החומרים מגיעים אל הגלאי בסדר הפוך.
HPLC הוא סוג הכרומטוגרפיה הנפוץ ביותר; 80% מההפרדות מבוצעות בשיטה זו. גם כאן מהווה המחיר הרב חסרון, ולעתים מכונה השיטה בהיתול High Price Liquid Chromatography (כרומטוגרפיית נוזל במחיר גבוה).
