Reakcja łańcuchowa polimerazy
Z Wikipedii
Reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) – łańcuchowa reakcja polimerazy, metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki. Technika wynaleziona w 1983 roku przez Kary'ego Mullisa i współpracowników z kalifornijskiej firmy Cetus. Za pracę w tej dziedzinie Kary Mullis otrzymał w roku 1993 Nagrodę Nobla.
Do reakcji wprowadza się matrycowy DNA, trifosforany deoksyrybonukleotydów, startery (primery), czyli krótkie (najczęściej ok. 20 nukleotydów) fragmenty DNA komplementarne do matrycy, oraz termostabilną polimerazę DNA (może nią być na przykład polimeraza Taq wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus lub polimeraza Pfu z archeowców Pyrococcus furiosis. Polimeraza Pfu charakteryzuje się większą progresywnością niż Taq, jednakże działa wolniej. Dostępne są także inne polimerazy, będące z reguły modyfikacjami wyżej wymienionych). W wyższej temperaturze (zwykle około 95°C) pękają wiązania wodorowe i podwójna helisa DNA rozdziela się na dwa pojedyncze łańcuchy. W temperaturze niższej, ściśle określonej dla danej pary starterów (pomiędzy 45-70°C), przyłączają się one do matrycy. Podwyższenie temperatury do około 72°C powoduje utworzenie się na matrycy, z przyłączonymi do niej starterami, kompleksu z polimerazą DNA, wskutek czego rozpoczyna się synteza nici komplementarnej do matrycy.
Gdyby wydajność metody była stuprocentowa, po n cyklach reakcji z jednej cząsteczki można by uzyskać 2n cząsteczek. W praktyce wydajność jest mniejsza, co nie zmienia faktu, że metoda PCR znajduje wiele zastosowań, m.in. w klonowaniu genów, diagnostyce klinicznej, identyfikacji osób zaginionych, kryminalistyce, pracach nad gatunkami, które wyginęły.
Stosuje się również modyfikacje metody PCR m.in:
- RT-PCR (Reverse Transcription) modyfikacja polegająca na użyciu mRNA jako matrycy. Synteza DNA na matrycy mRNA odbywa się przy użyciu odwrotnej transkryptazy (RT). Następnie DNA namnaża się za pomocą zwykłej reakcji PCR. Metoda ta pozwala na amplifikację wyłącznie sekwencji zawartej w dojrzałym mRNA, a więc tylko egzonów. Powstały DNA określany jest jako cDNA – komplementarny DNA.
- Real time PCR – do środowiska reakcji wprowadzane są znakowane (np. barwnikami fluorescencyjnymi) nukleotydy bądź sondy łączące się z DNA, które pozwalają na podstawie odczytów w kolejnych cyklach określić ilość matrycy użytej do reakcji, jak również śledzić ilość powstającego produktu.
- nested-PCR - stosowany gdy dysponujemy niewielką ilością matryc DNA. Jego istotą jest synteza kilku długich fragmentów zawierających interesujący nas fragment na początku reakcji (dzięki czemu powielamy nasz materiał badawczy) a dopiero w następnym kroku dodajemy startery okalające nasz badany odcinek.
- PCR-RFLP
- RG-PCR
- ACRS-PCR
- ARMS-PCR
- ASA-PCR
- PCR-ASO
- PCR-HD
- PCR-SSCP
- PCR-DGGE
- PCR-TGGE
- inversed PCR
- PCR-OLA
- PCR-CCM
- PCR-PTT
- RAPD-PCR (Losowa Amplifikacja Polimorficznego DNA)- metoda polega na użyciu jednego, krótkiego, losowego startera. Łączenie starterów przeprowadzane w niskiej temperaturze- obniżenie specyficzności. Otrzymujemy różnej długości prążki będące cechą charakterystyczną danego osobnika (fingerprinting). Niestety przez niską temperaturę łączenia starterów (konieczne by uzyskać wystarczającą ilość produktów) metoda ma niską powtarzalność, i wynik zależy od wielu trudnych do określenia czynników (np. niewielkie wahania temperatury, użyte odczynniki, czasy nagrzewania/chłodzenia)
- REP-PCR
[edytuj] Zobacz też
