聚合酶链锁反应

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PCR所配的热循环设备

聚合酶鏈鎖反應，Polymerase chain reaction，簡稱PCR，是一種分子生物学技術，用於扩增特定的DNA片段，這種方法可在生物體外進行，不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。PCR這項技術，被廣泛地運用在醫學和生物學的實驗室，例如用於判斷檢體中是否會表現某遺傳疾病的圖譜、傳染病的診斷、和克隆基因，以及亲子鑑定。

[编辑] 歷史

PCR這項技術是由凱利·穆利斯(Kary Mullis)發明，并因此在七年之後，1993年10月，獲得了諾貝爾化學獎该项殊榮。穆利斯的想法是，利用一種人工方法，和反覆相同程序的方法，並利用一種特殊的酶——即DNA聚合酶來扩增特定的DNA片段。

DNA聚合酶天然存在于生物体内，在细胞分裂前进行DNA的复制。當DNA開始複製時，解旋酶將雙股的DNA分開成兩個單股。DNA聚合酶便结合在兩DNA單股鏈上，生成互补链。在穆利斯最初的PCR反应中，将DNA聚合酶用于体外试验。双链DNA被加热到96℃，使得双链分离成为两条单链。但是在这个温度下，DNA聚合酶被破坏，因此在每个循环的加热步骤后必须补充新的聚合酶。穆利斯的原始PCR反应效率极低，需要大量时间和DNA聚合酶，并且在整个PCR反应中都需要人来照看。

后来，由嗜热细菌水生棲熱菌(Thermus aquaticus)体内产生的DNA聚合酶改善了这种低效的PCR反应。由于嗜热细菌生活在温度超过110℃的间歇泉中，它的DNA聚合酶具有耐热性。在用于PCR反应时，高温并不能破坏这种DNA聚合酶，因此不需要不断加入新的聚合酶，PCR反应由此变得简单并且可以由机器操作。

最初的具有耐热性的DNA聚合酶来自于水生棲熱菌(Thermus aquaticus)，因此被稱为Taq。Taq酶被广泛用于当前的PCR操作中。Taq酶的缺点是它缺少3'->5'校正外切酶活性，因此在复制DNA时有时会出错，造成DNA序列突变(错误)。从古菌中获得的Pwo酶及Pfu酶均有校正机制，能够大大降低PCR反应中的突变。将Taq与Pfu结合使用可以保证真实准确得扩增DNA。

[编辑] 专利之争

PCR技术的专利由Cetus公司持有，穆利斯发明PCR技术的时候在那个公司工作。Taq聚合酶也受专利保护。关于这个技术有几个诉讼案，包括著名的杜邦诉讼案。制药公司 Hoffmann-La Roche于1992年买下了专利并持有至今。

[编辑] 操作過程

PCR用于扩增一小段已知的DNA片断，可能是单个基因，或者仅仅是某个基因的一部分。与活体生物不同的是，PCR只能复制很短的DNA片断，通常不超过10kbp。DNA是双链分子，因此用互补DNA双链的构造单位(核苷酸)来度量其大小，单位为碱基对（base pair, bp）。某些特定的方法可以扩增40kbp左右的片断，但是这种大小与真核细胞的染色体DNA相比仍然是很少的。例如，人的体细胞DNA含有大约30亿个碱基对。 目前应用的PCR反应需要几个基本组成：

• DNA模板（template），含有需要扩增的DNA片断。
• 2个引物（primer），决定了需要扩增的起始和终止位置。（见下面引物一节）
• DNA聚合酶（polymerase），复制需要扩增的区域。
• 脱氧单核苷酸（dNTP），用于构造新的互补链。
• 缓冲体系，提供适合聚合酶行使功能的化学环境。

PCR反应在热循环设备中进行。PCR仪可以将反应管加热或冷却到每步反应所需的精确的温度。为防止反应体系中液体蒸发，通常在反应管上加盖加热的盖子，或者在反应体系表面加入一层石蜡油。

[编辑] 引物

特定的引物决定了所扩增的DNA片断。引物是人工合成的短DNA片断，一般不超过50个碱基(通常18－25个)，它们与所要扩增的DNA片断的起始和终止区域完全互补。在“黏合”时引物结合于DNA模板的起始和终止点，DNA聚合酶结合到这两个位置，开始合成新的DNA链。

选择引物的长度和熔点(T_m)要考虑许多条件。引物的熔点与PCR第一步中DNA的熔点不同，是指50％的引物与模板结合的温度，高于这个温度引物与模板就不能结合。这个温度随着引物长度的增加而升高。如果引物长度太短，就有可能与DNA模板的几个位置结合，造成非特异性复制。另一方面，引物长度也受限于T_m。如果T_m太高，即高于80℃，也会导致问题，因为DNA聚合酶在此温度下活性较低。引物最优长度通常为20到40个碱基，熔点从60℃到75℃。

有时也用到简并引物，是一些相似但不相同的的引物的混合物。通常用于从不同的生物DNA中扩增相同的基因，因为这些基因通常都是近似但不相同的。应用兼并引物的另一种情况是根据蛋白质序列设计引物时，由于几个不同的密码子都能编码一个氨基酸，通常难以判断在DNA中究竟是哪个密码子编码的这个氨基酸。例如编码异亮氨酸的引物可能使用"ATH"，A是腺嘌呤，T是胸腺嘧啶，H可能是腺嘌呤，胸腺嘧啶或者胞嘧啶(关于碱基如何编码蛋白质，可查看遗传密码)。使用简并引物在很大程度上降低了PCR扩增等特异性，这个问题可以使用递减PCR(touchdown PCR)部分地解决。

基于上述考虑，设计引物可以采取以下原则：

• GC所占比例为40％－60％
• 计算两个引物的T_m，使之不相差5℃，并且扩增产物的T_m与引物的相差不超过10℃。
• 黏合温度通常比计算的最低T_m低5℃，但是要根据经验为不同条件下的PCR选择不同的黏合温度。
• 内部的具有自身互补性的发卡结构不超过4个，其二聚体中不超过8个。
• 3'末端尤其重要，必须不含有与其他引物互补的序列，并且要与模板完全互补。

现有一些帮助设计引物的程序(见外部链接)。

[编辑] 步骤

一般的PCR反应由20到30个循环组成，每个循环包括以下3个步骤：

• 利用高溫(93-97℃)使双链DNA分離(熔解)。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前，通常加热长一些时间以确保模板和引物完全分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟。
• 在DNA双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA上(降溫)。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的黏合温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。
• 最后，DNA聚合酶由退火时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链(延长)。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片断长度。估计合成1000bp大概需要1分钟。

聚合酶鏈鎖反應簡圖 (1) 96℃高溫下使雙股DNA打開 (2) 在約68℃下讓引子與DNA配對 (3) 在72℃ DNA延長 (P=聚合酶). (4) 第一循環完成，做出的兩段雙股DNA又可當作下一個循環模板，这样每次循环都使得扩增的DNA片段加倍。

[编辑] 实例

[编辑] 优化PCR

[编辑] PCR技術最新进展

；==PCR的各種變體==

• 遞減PCR(touchdown PCR)：前幾循環溫度逐漸下降。
• 逆轉錄PCR(RT-PCR)：以由mRNA逆轉錄而來的DNA爲模板，由此產生出來的DNA不帶有內含子(基因中不具意義的段落)，常應用於分子克隆技術。
• 即時PCR(real-time PCR)：PCR過程中利用螢光探針或染料半定量檢測，又稱定量PCR(quantitative PCR)。
• 巢式PCR(nested PCR)：先用低特異性引物擴增幾個循環以增加模板數量，再用高特異性引物擴增。
• 多重PCR(multiplex PCR)：在同一個管中使用多組引物。
• 復原條件PCR(reconditioning PCR)：PCR產物稀釋10倍後重新放入原濃度的引物和dNTP等循環3次，以消除產物中的異二聚體。

[编辑] PCR的應用

• 基因圖譜建立
• 親子鑑定
• 偵測遺傳疾病
• 克隆基因
• 基因突變研究
• DNA遺傳演化
• 基因表現比較

[编辑] 鉴定基因

[编辑] 亲子鉴定

[编辑] 诊断遗传病

[编辑] 克隆基因

[编辑] 诱变

[编辑] 分析远古DNA

[编辑] 鉴定特定表型的突变体基因

[编辑] 比较基因表达量

[编辑] 外部链接

• The reference in real-time PCR
• eQMS::DNA DNA Fingerprint Software

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