HPLC

Z Wikipedii

HPLC (ang. High Performance Liquid Chromatography - wysokosprawna chromatografia cieczowa) - to metoda analityczna a także preparatywna, służąca do oczyszczania i identyfikacji substancji chemicznych.

Jest to rodzaj cieczowej chromatografii kolumnowej. Oznacza to, że analizowana próbka, jest rozpuszczana w rozpuszczalniku transportującym (tzw. eluencie) i w tej formie jest kierowana na kolumny, które wypełnione są specjalnym złożem porowatym lub żelowym. Na skutek oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami chemicznymi tworzącymi analizowaną próbkę a wypełnieniem kolumny następuje ich rozdział. Te związki chemiczne, które silniej oddziałują ze złożem (mają tzw. większe powinowactwo do złoża) przepływają wolniej przez kolumnę, zaś związki chemiczne, które oddziałują słabiej przepływają szybciej.

HPLC różni się od zwykłej chromatografii cieczowej ciśnieniem pod jakim podawany jest eluent na kolumny. Są to dość znaczne ciśnienia, przekraczające 100 atm. Dzięki takiemu ciśnieniu złoże w kolumnach HPLC może być bardziej "upakowane" niż w kolumnach do zwykłej, niskociśnieniowej chromatografii cieczowej, co powoduje znacznie lepszy rozdział analizowanych mieszanin na poszczególne związki chemiczne, w znacznie krótszym czasie, przy mniejszym zużyciu eleunta i mniejszej ilości analizowanej próbki. Zdolności rozdzielcze HPLC są zbliżone, a nawet czasem większe od zdolności rozdzielczych chromatografii gazowej.

W HPLC duże znaczenie dla rozdziału ma polarność faz. Początkowo, stosowano normalny układ faz ( NP), w którym faza stacjonarna jest znacznie bardziej polarna niż faza ruchoma (Np. układ: żel krzemionkowy – heksan). Obecnie stosuje się odwrócony układ faz (RP), w którym faza stacjonarna jest niepolarna, a faza ruchoma polarna [Np. układ: żel krzemionkowy z modyfikowaną powierzchnią (grupy oktadecylowe tzw. szczotka oktadecylowa) – mieszanina metanolu i wody]. Układy RP mają bardziej trwałe wypełnia, cechują się niższym kosztem fazy ruchomej.

Aparaty HPLC składają się zwykle z:

• zbiornika na eluent
• pompy, zapewniającej stałe ciśnienie eluenta w układzie
• injektora - przyrządu umożliwiającego wstrzykiwanie analizowanych próbek bez rozszczelnienia układu (zwykle dzięki zastosowaniu tzw. martwej pętli)
• filtrów, zwanych też prekolumnami, które usuwają z eleunta wszelkie zanieczyszczenie, które mogłyby zniszczyć wypełnienie kolumn
• zestawu kolumn z odpowiednim wypełnieniem
• detektora - którym jest zazwyczaj rodzaj uproszczonego spektrometru UV-VIS, spektrometru fluorescencyjnego, spektrometru mas lub coraz częściej laserowego spektrometru rozproszeniowego
• zbiornika na zużyty eluent, lub w przypadku aparatów preparatywnych kolektora frakcji (tzw. karuzeli) - systemu zbiorniczków, które są automatycznie zmieniane, gdy detektor stwierdza wypływ kolejnego rozdzielanego związku chemicznego.

W typowym, analitycznym aparacie HPLC, analiza jednej próbki trwa ok 20 min. Kolumny HPLC mają przeciętnie długość od 10 cm do 50cm, bywają jednak kolumny o długości przekraczającej 1m, i przekrój wewnętrzny od 1 do 7-8 mm i mogą być zestawiane w układy o określonej zdolności rozdzielczej. W czasie jednej analizy zużywa się ok 5-20 ml eleuenta, który można po analizie poddać regeneracji przez destylację. Jako eluent stosuje się rozmaite rozpuszczalniki organiczne (metanol, chlorek metylenu, THF, toluen, etanol, acetonitryl, rozmaite bufory i inne.) Analizowana próbka ma zwykle objętość od 1 do 100 µl

Do analiz bardzo małych ilości związków chemicznych stosuje się chromatografy typu nanoHPLC. Kolumny tych chromatografów mają średnicę kilkudziesięciu µm i długość od kilkunastu do kilkudziesięciu cm. Chromatografy nanoHPLC pracują przy szybkości przepływu eluenta rzędu kilkuset nl na minutę. Analiza próbki trwa kilkadziesiąt do kilkuset minut. Chromatografy nanoHPLC charakteryzują się bardzo dużą rozdzielczością.

Aparaty do preparatywnego HPLC, posiadają kolumny o znacznie większych przekrojach od aparatów do analitycznego HPLC (rzędu 2-3 cm), co umożliwia rozdzielanie na nich większych objętości analizowanych substancji - rzędu 1-5 ml.

Szczególnym przypadkiem HPLC jest SEC (Size exlusion chromatography) zwany również GPC (gel permeation chromatoraphy). Techniki te są oparte na porowatych wypełnieniach żelowych, w których rozdział następuje nie wskutek powinowactwa chemicznego analizowanych związków do wypełnienia, lecz na rodzaju filtracji przez pory. Przez kolumny SEC szybciej przechodzą związki o większej masie cząsteczkowej a wolniej te o mniejszej masie cząsteczkowej niezależnie od ich struktury chemicznej. Jest to metoda stosowana do oznaczania średnich mas cząsteczkowych polimerów i ich polidyspersji.