GFP
מתוך ויקיפדיה, האנציקלופדיה החופשית
GFP (מאנגלית: Green fluorescent protein; חלבון פלואורסנטי ירוק), חלבון בן 238 חומצות אמינו (23kDa) מהמדוזה Aequorea victoria אשר בחשיפה לאור כחול פולט אור ירוק. ל-GFP צורה ייחודית דמוית פחית, המורכבת ממבנה β-barrel הבנוי מ-11 גדילים וגדיל סליל אלפא הכולל את הכרומופור העובר במרכז. מבנה חבית זה מאפשר את התצורה של הכרומופור ומגן עליו מפני תהליך של ירידה בעוצמת הפלאורוסנציה (quenching) שעשויה להיגרם מהשפעת הסביבה. בתאים ובביולוגיה מולקולרית נעשה שימוש רב בגן ה-GFP כגן מדווח. בחלבון נעשה שימוש בחיישנים ביולוגיים שונים ואורגניזמים רבים הונדסו גנטית כך שיבטאו את החלבון. בעוד שרוב המולקולות הפלואורסנטיות, כדוגמת FITC (פלואורסצאין איזותיוציאנאט), הן פוטוטוקסיות מאוד כאשר נעשה בהם שימוש בתאים חיים, חלבונים פלואורסנטיים כ-GFP הם לרוב הרבה פחות מזיקים כאשר הם מאירים בתא חי. בשל תכונות אלו פותחו מערכות מיקרוסקופיה פלואורסנטית אשר יכולות לשמש למעקב לאורך זמן אחר תאים אשר מבטאים חלבון אחד או יותר המסומנים עם חלבונים פלאורוסנטיים. ניתוח של מעקבים כאלו תרם להבנתם של תהליכים ביולוגיים רבים, בהם אריזת חלבונים, העברת חלבונים, ודינמיקה של רנ"א. שימוש חשוב נוסף ב-GFP הוא לבטא חלבון במערך קטן של תאים מסוימים, והודות לכך יכולים חוקרים לזהות בצורה אופטית סוגים מסוימים של תאים מחוץ לגוף האורגניזם (על צלחת) או אף בגוף האורגניזם.
[עריכה] היסטוריה
בשנות השישים והשבעים של המאה ה-20 בודד לראשונה GFP מן המדוזה A. victoria ותכונותיו הפלואורסנטיים נחקרו על ידי אוסמו שימורה.[1] במדוזה זו, הפלואורסנציה של GFP מתרחשת, כאשר החלבון המאיר אאקורין (Aequorin) נקשר ליוני Ca2+ ונוצר זוהר כחול, וחלק מהאנרגיה לאור מועברת ל-GFP, אשר מסיט את הצבע לירוק. התועלת של שימוש בחלבון ככלי בביולוגיה מולקולרית לא הובנה עד 1992, כאשר דוגלס פרשר (Douglas Prasher) דיווח על שיבוט וריצוף של הגן המקודד לחלבון GFP.[2] המימון למחקר זה אזל, ובעקבות זאת שלח פרשר דוגמות cDNA למספר מעבדות. מעבדתו של מרטין צ'לפי (Martin Chalfie) הצליחה לגרום לביטוי של חלבון ה-GFP בתאים הטרולוגיים של החיידק E. coli וכן של הנמטודה C. elegans, ופרסמו את תוצאותיהם במגזין Science בשנת 1994.[3] המעבדה של פרדריק טסוג'י (Frederick Tsuji) דיווחה באופן עצמאי על ביטוי של החלבון הרקומביננטי חודש לאחר מכן[4]. תכונה חשובה של ה-GFP היא שהוא מקופל ופלואורסנטי בטמפרטורת החדר, ואיננו זקוק לקופקטורים אקסוגניים הייחודיים למדוזות. אף על פי שה-GFP בצורתו הטבעית פלואורסנטי יש לו כמה מגרעות, כדוגמת יציבות אור לא טובה וקיפול לא טוב ב-37°C.
המבנה הגבישי המדווח הראשון של GFP נעשה על מוטנט S65T על ידי קבוצת חוקרים מאוניברסיטת אורגון ב-Science ב-1996. חודש לאחר מכן דיווחה באופן עצמאי קבוצה אחרת מאוניברסיטת הוסטון ב-Nature Biotech על המבנה של זן הבר של GFP.[5] המידע על מבנה ה-GFP סיפק רקע חיוני על תצורת הכרומופור ועל אניטרקציות של שיירים סמוכים. חוקרים ערכו שינויים בשיירים אלו באמצעות מוטציות מכוונות ואקראיות כדי ליצור את המגוון הרחב של נגזרות GFP אשר קיימים כיום.
[עריכה] מוטציות
עקב הפוטנציאל לשימוש נרחב והדרישות המשתנות של החוקרים, מוטנטים רבים ושונים של חלבון ה-GFP הונדסו. השיפור המשמעותי הראשון נעשה במוטצית התמרה (S65T) שעליה דווח ב-Nature ב-1995[6]. מוטציה זו שיפרה במידה ניכרת את התכונות הספקטרליות של GFP, ובכך הגבירה את הפלואורסנציה, יציבות האור, והסיטה את נקודת העירור הראשית ל-488nm בעוד ששיא הפליטה נותר ב-509nm. תכונות אלו תאמו את התכונות הספקטרליות שניתן היה למדוד אותן באמצעות מערכות לקריאת FITC, וכך השימוש ב-GFP הפך למעשי יותר עבור החוקר הכללי. מוטציה נוספת שנעשתה, F64L, שיפרה את התקפלות החלבון ב-37°C. סדרת מוטציות נוספות שדווח עליהן ב-2006[7] איפשרו יצירה של חלבון GFP אשר מתקפל היטב גם כאשר הוא מאוחד עם פפטידים שאינם מתקפלים היטב.
מוטציות רבות נוספות נעשו, בהם גם מוטנטים בעלי צבעים שונים, בהם חלבון פלואורסנטי כחול (EBFP, EBFP2, Azurite), חלבון פלואורסנטי כחול-ירקרק (ECFP, Cerulean, CyPet) וכן נגזרות חלבון פלואורסנטי צהוב (YFP, Citrine, Venus, YPet).
בצורתו הטבעית של ה-GFP (wild-type GFP) מ-A. victoria שיא העירור הראשי הוא באורך גל 395nm, שיא העירור המשני הוא באורך גל 475nm, ושיא הפליטה הוא ב-509nm.
