Résonance magnétique nucléaire

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Spectromètre.

La résonance magnétique nucléaire est une technique de spectroscopie appliquée aux particules ou ensembles de particules atomiques qui ont un spin nucléaire non nul.

C'est un phénomène par lequel un noyau de l'atome considéré absorbe les rayonnements électromagnétiques d'une fréquence spécifique en présence d'un fort champ magnétique. Isidor Isaac Rabi a découvert ce phénomène en 1938. La résonance magnétique a été, par la suite, appliquée à la détection des atomes légers tel que l'hydrogène.

Ses applications concernent la physique, la chimie et l'imagerie médicale.

[modifier] Principe

Dans cette méthode, on utilise le spin des noyaux des atomes. Certains noyaux possèdent un spin nul (ceux dont le nombre de protons et de neutrons sont tous les deux pairs) mais d'autres ont un spin nucléaire différent de zéro, ce qui implique que l'on peut leur associer un moment magnétique de spin qui se comporte comme un moment magnétique (i.e. une sorte de petit aimant). Les atomes de carbone 12 et d'oxygène 16 sont très répandus mais leur spin nucléaire est nul. En revanche, l'hydrogène n'a qu'un proton et son moment magnétique nucléaire est ainsi non nul : la résonance magnétique de l'hydrogène (du proton) est la plus utilisée. Il est en particulier important de faire remarquer que l'adjectif nucléaire employé ici n'a aucun rapport avec les phénomènes de radioactivité, mais fait juste référence au noyau atomique.

La physique quantique nous apprend qu'un moment magnétique de spin 1/2 placé dans un champ magnétique extérieur peut avoir 2 énergies possibles (2 niveaux d'énergie). On peut par exemple le constater expérimentalement pour des électrons, c'est l'effet Zeeman. La RMN consiste à modifier le moment magnétique nucléaire, autrement dit à faire passer le noyau d'un niveau d'énergie à un autre, (ce qui revient à « retourner » le spin) par absorption d'un photon : lorsque l'énergie du photon (et donc la fréquence de l'onde électromagnétique) permet cette transition, il y a résonance. Pour les champs usuels (de l'ordre du tesla), la résonance du proton a lieu dans le domaine des ondes radio (100 MHz environ) : 42 MHz dans un champ de 1,0 T et 63 MHz dans un champ de 1,5 T.

La relation mathématique existant entre le champ magnétique imposé de norme $B 0$ et la fréquence de résonance (retournement de spin) $ν 0$ est très simple :

$\nu_{0} = \gamma\times {B_{0} \over 2\pi}$

où $γ$ est le rapport gyromagnétique caractéristique de chaque noyau étudié.

Ainsi le tableau suivant donne les valeurs de $γ$ pour les noyaux les plus courants :

Noyau	Spin Net	$γ$ (MHz/T)
¹H	1/2	42,58
³¹P	1/2	17,25
¹⁴N	1	3,08
¹³C	1/2	10,71
¹⁹F	1/2	40,08

On voit ainsi que la fréquence de l'onde électromagnétique nécessaire pour la résonance du proton est environ 4 fois plus élevée que celle nécessaire pour la résonance du ¹³C.

La transition du spin vers son retour à l'équilibre (la relaxation) entraîne l'émission d'une onde électromagnétique qui peut être détectée par un capteur.

En imagerie par résonance magnétique (IRM), on mesure ainsi la réponse de chaque voxel (volume de base de l'échantillon examiné), déterminant la densité en protons et reconstituant une image.

[modifier] Historique

En 1938, Isidor Isaac Rabi découvre le phénomène de résonance magnétique sur des jets moléculaires.
En 1946, Felix Bloch et Edward Mills Purcell précisent la notion de fréquence de résonance.
C'est sous le terme de zeugmatomographie (zeugma étant un terme grec signifiant « union ») qu'est apparue son application en imagerie, créée en 1973 par Paul Lauterbur, prix Nobel de physiologie et de médecine en 2003 pour cette invention.

[modifier] Utilisations

Le caractère non destructif de cette technique analytique a conduit à divers développements de cette méthode qui est désormais employée en médecine pour étudier le corps humain (IRM), ou en chimie organique pour réaliser des analyses structurales.

C'est un outil de biophysique très utilisé en génomique structurale pour obtenir une 'image' en 3D des molécules du vivant.

[modifier] La RMN en chimie organique

Spectromètre RMN 200 MHz avec passeur automatique d'échantillons utilisé en chimie organique pour la détermination des structures chimiques.

La RMN est l'outil d'analyse actuellement le plus utilisé en chimie organique. Elle permet d'obtenir des informations qualitatives ou quantitatives sur l'échantillon analysé, suivant la technique employée. Les noyaux les plus souvent étudiés sont le ¹H, le ¹³C, le ¹⁷O, le ³¹P et le ¹⁹F qui présentent, pour la plupart, un spin nucléaire non nul égal à 1/2. Le ¹⁴N quant à lui présente un spin nucléaire égal à 1 tandis que celui de l'oxygène est de 5/2.

L'échantillon à analyser est mis en solution dans un solvant deutéré (voir ²D, un isotope de l'¹H présentant un spin nucléaire égal à un). Ce solvant, généralement du chloroforme deutéré, (CDCl₃) est normalement invisible en RMN du proton, puisque le deutérium a une fréquence de résonance bien différente de celle de l'hydrogène (le rapport gyromagnétique vaut 6,54 MHz/T dans le cas du Deutérium).

Considérons la RMN du ¹H : l'environnement chimique des atomes d'hydrogène qui sont reliés chimiquement aux molécules de l'échantillon influent sur la fréquence de résonance de ceux-ci ; ainsi, l'hydrogène d'un groupement alcool (-OH) aura une fréquence de résonance $ν1$ supérieure à celle de l'hydrogène d'un groupement carboxyle (-COOH) $ν2$ . Comme la différence entre ces deux fréquences est de quelques Herz, les chimistes ont défini une autre grandeur : le déplacement chimique (chemical shift), et se réfèrent à une fréquence de retournement de spin étalon, celle du tétraméthylsilane (TMS), que l'on introduit dans l'échantillon.

La relation entre la fréquence de résonance de l'échantillon $ν1$ et le déplacement chimique correspondant $δ1$ est donnée par le calcul suivant :

   $δ 1 = 1000000 * (ν 1 - ν T M S) / ν a p p a r e i l$

Dans les cas cités, le déplacement chimique vaut environ 4 pour RO-H, et 11 pour R-COO-H.

La RMN du ¹H peut être relativement rapide (ordre d'idée : 2 min) et permet une analyse quantitative aisée. Grâce à l'interprétation de la nature des massifs obtenus (multiplets) et à la connaissance empirique des déplacements chimiques des protons présents dans chaque groupement fonctionnel, il est possible de déterminer la structure développée de toutes les molécules organiques par application d'un raisonnement logique simple.

La RMN du ¹³C permet de retrouver tous les carbones de la molécule grâce, là aussi, à la connaissance empirique des déplacements chimiques des carbones faisant partie de divers groupements fonctionnels. Les appareils récents permettent d'obtenir rapidement les spectres RMN ¹H et ¹³C, ceux-ci avec ou sans découplage du proton.

[modifier] La RMN impulsionnelle

Les premières méthodes utilisées étaient soit de garder le champ magnétique constant et de balayer les fréquences, soit de garder la fréquence constante et de balayer le champ magnétique. Ces méthodes etaient longues car nécéssitaient le relevé d'un grand nombre de mesures. La RMN impulsionnelle permet de gagner énormément de temps. Une impulsion éléctromagnétique extrèmement brève et intense est envoyé sur l'échantillon. Or plus une impulsion est brève, plus son spectre est large. Ce sont donc tous les noyaux qui vont être stimulés en même temps. Il suffit donc de récuperer le signal réémis par l'échantillon et de le décomposer en fonction simple grace à des séries de Fourrier. De cette manière, on extrait le spectre RMN après un traitement mathématique mais en n'ayant fait qu'une mesure.

[modifier] La RMN en imagerie médicale et biophysique

IRM encéphalique (coupe sagittale passant par la ligne médiane)

L'imagerie par résonance magnétique nucléaire (IRM) est une technique d'imagerie médicale permettant d'avoir une vue 2D ou 3D d'une partie du corps. Cette technique est très utile pour l'observation du cerveau. Grâce aux différentes séquences (séquence IRM), on peut observer différents tissus avec des contrastes très élevés car la résolution en contraste est nettement meilleure que celle du scanner.

Voir l'article imagerie par résonance magnétique

[modifier] La RMN en biologie structurale

À côté de la radiocristallographie, la RMN est devenue une méthode d'étude des macromolécules biologiques en solution. Elle ne nécessite pas l'obtention de monocristaux et permet d'étudier des protéines, des acides nucléiques à des concentrations millimolaires. Les techniques de RMN multidimensionnelles conduisent à corréler les fréquences de plusieurs spins et de résoudre les ambiguïtés liées aux superpositions spectrales. Des protéines de masse moléculaire de 10 à 30 kDa peuvent être analysées ainsi que des oligonucléotides de plusieurs dizaines de paires de bases.

Spectromètre RMN 800 MHz utilisé en biologie structurale.

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[modifier] RMN homonucléaire sans marquage isotopique

Historiquement, les protéines ont été étudiées par la RMN du proton (isotope ¹H) présent en abondance. Une première étape consiste à attribuer les résonances, c'est-à-dire à établir une corrélation entre les signaux du spectre et les atomes d'hydrogène de la molécule. Deux expériences clefs sont utilisées, l'expérience de corrélation par les couplages scalaires (HOHAHA ou TOCSY) et l'expérience de corrélation à travers l'espace par effet Overhauser (NOESY). Cette attribution est dite séquentielle, car elle opère par positionnement relatif d'un noyau par rapport à ses voisins en utilisant l'information de la séquence peptidique. Ce processus d'attribution (semblable à un puzzle) devient de plus en plus complexe à mesure que la taille de la protéine augmente; de plus, l'effet Overhauser se transmet à travers l'espace et ne permet pas de distinguer des noyaux proches dans la séquence peptidique et ceux proches dans l'espace. Des erreurs sont donc possibles qui ne se détectent qu'à la fin du processus, lorsque certaines pièces du puzzle restent sur le tapis.

Une fois les spectres attribués, les informations sont alors utilisées de manière quantitative: les couplages scalaires renseignent sur les angles dièdres et les effets Overhauser sur des distances interatomiques (jusqu'à 4-6 Angstroms). Ces informations sont introduites dans des programmes de modélisation moléculaire pour rechercher une ou plusieurs conformations de la molécule compatibles avec les données. La stratégie est comparable à celle du géomètre qui mesure des distances et des angles entre bâtiments et recalcule un plan de ville. Sauf que la portée des distances mesurées en RMN est faible par rapport aux objets évalués; l'accumulation des erreurs expérimentales et/ou le faible nombre de données conduit à des structures localement mal définies.

Deux difficultés limitent la taille des macromolécules étudiables: la complexité des spectres et la largeur individuelle de chaque signal. Si la taille de la protéine double, le nombre de résonances dans le spectre va doubler sans que la dispersion (c'est-à-dire la largeur spectrale) n'augmente. Une solution consiste à recourir à un spectromètre RMN à plus haut champ… et donc beaucoup plus coûteux. Si la taille double, la masse moléculaire augmente et la protéine tourne plus lentement sur elle-même par mouvement diffusif. Cela conduit à des signaux plus larges, car la relaxation transversale devient plus performante. L'augmentation du champ magnétique est sans effet… et il faut trouver une autre parade au problème (réduction de la viscosité, réduction du nombre de protons voisins…).

[modifier] RMN hétéronucléaire avec marquage isotopique

Afin de résoudre les superpositions spectrales dans les grosses molécules, il s'avérait nécessaire de passer de la RMN 2D à la RMN 3D. Des essais peu fructueux ont été faits au début des années 1990 pour combiner les séquences HOHAHA et NOESY dans une expérience tridimensionnelle. Si on dispose d'une protéine entièrement enrichie en ¹⁵N et en ¹³C, on peut concevoir des expériences de corrélation entre spins, uniquement basées sur des couplages scalaires et permettant de relier tout le squelette peptidique ainsi que les chaînes latérales. Les isotopes naturellement abondants sont respectivement le ¹⁴N (noyau quadrupolaire) et le ¹²C (noyau invisible en RMN), mais la plupart des protéines étant obtenues par surexpression bactérienne, il est possible de faire des cultures sur des milieux enrichis isotopiquement.

Cette nouvelle stratégie fait appel à une série d'expériences 3D triple résonance: 3D car un spectre tridimensionnel est obtenu, triple résonance car les fréquences de trois noyaux différents sont détectées. Pour des raisons de sensibilité, toutes ces séquences partent du ¹H (noyau au rapport gyromagnétique élevé) et se terminent par la détection du même noyau. Dans l'expérience HNCO, on établit donc une corrélation entre le proton amide (^HN), son azote (N) et le carbonyle (CO) de l'acide aminé précédent. Les couplages scalaires utilisés pour les transferts de cohérence sont des couplages ¹J (à une liaison) et donc relativement importants (¹JNH = 90 Hz et ¹JNCO=15Hz). Cela assure donc une grande efficacité de transfert même dans le cas de protéines de masse élevées (largeur de raie). À noter que cette expérience HNCO permet de relier par couplage scalaire des acides aminés, ce que la stratégie homonucléaire ne permettait pas (absence de couplage scalaire 3J à travers la liaison peptidique)