Luciferine

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Luciferine sind unterschiedliche Naturstoffe, die von verschiedenen Organismen synthetisiert werden. Sowohl die Luciferine als auch die Luciferasen sind art- oder gruppenspezifisch, also für jede Tiergruppe kennzeichnend. In Gegenwart des entsprechenden Luciferase-Enzyms reagieren sie mit Sauerstoff (Oxidation). Bei der Veränderung, meistens der Abspaltung von Teilgruppen an dem Luciferin, entsteht Energie, die als Lichtquant abgegeben wird.

[Bearbeiten] Geschichte und Allgemeines

Die ersten Arbeiten auf Luciferin-Luciferase-Systeme gehen auf den Franzosen Raphael Dubois zurück. Er entdeckte bei Arbeiten an Leuchtkäfern 1885, dass eine Substanz in einer lichtgebenden Reaktion verbraucht wird. Er bezeichnete diese als Luciferin. Dieses wird auch durch Hitze nicht zerstört. Die andere, hitzelabile Komponente hat der Wissenschaftler als Luciferase bezeichnet. Heutzutage wird Luciferase allgemein als das Enzym bezeichnet, dass das dazugehörende Luciferin umsetzt.

Der nächsten Untersuchungen wurden von Amerikaner Newton Harvey Anfang des 20. Jahrhunderts durchgeführt.^[1] Er hat herausgefunden, dass es in jedem Luciferin-Luciferase-System eine Spezifität gibt. So können Luciferine der einen Spezies nicht durch die Luciferase einer artfremden Spezies umgesetzt werden. Schließlich benötigt jedes biolumineszente System Sauerstoff. Dies wurde aber auch bereits im 18. Jahrhundert von Robert Boyle beobachtet).

Biolumiszente Systeme sind nicht evolutionär konserviert, die Luciferasen teilen keine Sequenzhomologie. Luciferasen treten aber in 17 unterschiedlichen Stämmen und –mindestens 700 Gattungen - meist marinen -auf.^[2] Offenbar wurden sie öfters „erfunden“, phylogenetische Studien wiesen darauf hin, dass Luciferin-Luciferase-Systeme mehr als 30 unabhängige Ursprünge besitzen.^[3]

Laut klassischer Definition ist das an der Luciferase gebundene Luciferin der Lichtemitter. Die Luciferase setzt unter Verbrauch von Sauerstoff das Luciferin hierbei um, manchmal werden dafür auch Cofaktoren wie ATP oder Ionen benötigt. Das oxidierte Luciferin befindet sich zunächst in einem Übergangszustand I und gelangt dann - häufig nach Decarboxylierung und weiteren Zwischenschritten - in einen elektronisch angeregten Zustand P*. Dieser fällt nach recht kurzer Zeit (wenige Nanosekunden) zurück in seinen Grundzustand P und emittiert währenddessen einen Lichtquant. Normalerweise sind die umgesetzten Luciferine auch Fluorophore, da sie durch Bestrahlen von Licht in einen angeregten Zustand gelangen können.

Luciferine werden durch Luciferasen unter Verbrauch von Sauerstoff umgesetzt, dabei entsteht ein Molekül in einem elektronisch angeregten Zustand P^*. Nach einer kurzen Lebenszeit wird ein Photon emittiert und der Grundzustand P erreicht.

[Bearbeiten] Prinzipien

Um in den angeregten Zustand P* zu gelangen, ist biochemisch gesehen viel Energie nötig. Die Emission eines Photons mit einer Wellenlänge von 500 nm (grün) benötigt nämlich ca. 250 kJ/mol - zum Vergleich: die Hydrolyse von ATP zu ADP und Pyrophosphat setzt ca. 30 kJ/mol frei. Außerdem kann die Energie nur in einen Schritt freigesetzt werden.

Das häufige Prinzip ist die Generierung eines Vierrings, einem Dioxetan bzw. Dioxetanon. Nach erfolgter Decarboxylierung bildet sich der elektronisch angeregten Zustand.

Ein Dioxetanon ist instabil und zerfällt unter Abspaltung von CO₂. Dies erzeugt ein Keton im elektronisch angeregten Zustand.

Manchmal entspricht die Fluoreszenz nicht der erwarteten, zum Beispiel bei Studien in vitro (im Reagenzglas). Dafür gibt es verschiedene Ursachen. So emittieren an Enzyme gebundene Luciferine anders als freie Luciferine nach Anregung durch Licht. Manchmal wird die Energie an einen zweiten Flurophor übertragen, so wie es beispielsweise bei Aequorin zu GFP in A. victoria geschieht.

[Bearbeiten] Quantenausbeute Q

Ob die Umsetzung eines Luciferins durch die korrespondierende Luciferase effizient ist, wird durch die sogenannte Quantenausbeute Q (quantum yield) determiniert. Sie ist definiert als die Anzahl der emittierten Lichtquanten pro dafür umgesetzte Moleküle Luciferine.^[4] Definitionsbedingt ist der Höchstwert von Q gleich 1, dies würde nämlich bedeuten, dass bei jedem umgesetzten Luciferin auch ein Lichtquant frei wird.

[Bearbeiten] Luciferin-Arten

Luciferin-Luciferase-Systeme kommen in zahlreichen Arten vor. Es gibt vier Hauptklassen an Luciferin-Luciferase-Systemen, bei denen das Luciferin nach Umsetzung durch eine Luciferase in einen elektronisch angeregten Zustand überführt und damit der eigentliche Lichtemitter wird.

[Bearbeiten] Das Firefly-Luciferin, ein Benzothiazolen

Strukturformel von D-Luciferin^[5] aus Leuchtkäfern.

Die meisten biolumineszenten Insekten sind Käfer (Coleoptera) in den Familien Phengodidae (Federleuchtkäfer) und Elateridae (Schnellkäfer, Leuchtkäfer). Das Luciferin-Luciferase-System des nordamerikanischen Leuchtkäfers Photinus pyralis (engl. firefly) ist dabei am besten untersucht. Die Luciferase (EC 1.13.12.7 ^[6]), ein ca. 60 kD großes Enzym, katalysiert die oxidative Decarboxylierung von D-Luciferin (ein Benzothiazol) zu Oxyluciferin (vgl. untenstehende Abbildung, Kasten). Dafür benötigt sie neben Magnesiumionen auch ATP als Cofaktor. Die Reaktion findet in der Peroxisomen der Lichtorganzellen statt.^[7]

Die Lichtausbeute dieser Reaktion ist außerordentlich hoch, da die Quantenausbeute Q bei 41 % liegt.^[8] Je nach Art liegt das Emissionsmaximum λ_max des freigesetzten Lichts zwischen 530 nm und 635 nm.

Wie die Insekten - oder mikrobielle Symbionten - des Luciferin herstellen, ist nicht ganz geklärt. Man weiß, dass D-Luciferin nicht direkt vom Käfer aufgenommen wird (es sei denn bei weiblichen Käfern der Art Photuris, die ihre männliche Artgenossen fressen).^[9] Eine Möglichkeit besteht darin, das nach der Lichtreaktion entstandene Oxyluciferin zurück zu Luciferin zu recyclen. Hierbei soll zunächst das Oxyluciferin zu 2-Cyano-6-hydroxybenzothiazol (2C6HB) umgewandelt werden, was durch das Luciferin-regenerierende Enzym (LRE)^[10] katalysiert wird. 2C6HB kondensiert dann mit einem D-Cystein zu D-Luciferin. Diese Kondensationsreaktion wird auch bei der chemischen Luciferinsynthese genutzt (vgl. Abbildung rechter Weg).

Eine seit kurzem diskutiere Möglichkeit geht indes davon aus, dass 2C6HB mit L-Cystein zunächst L-Luciferin bildet. Dieses wird dann über Zwischenschritte zu D-Luciferin racemisiert (vergleiche auch Abbildung linker Weg).^[11]

Zwei vorgeschlagene Mechanismen für die Regeneration D-Luciferins aus Oxyluciferin (siehe hierbei auch Text). Abkürzungen: LH₂ Luciferin; HS-CoA Coenzym A; 2C6HB 2-Cyano-6-hydroxybenzothiazol; L Oxyluciferin; Cys Cystein; TGA Mercaptoessigsäure.

Beide Möglichkeiten dieser Biosynthese weisen noch einige Probleme auf:

So wird das Luciferin-regenerierende Enzym in den lichtproduzierenden Organen biolumineszenter Käfer nicht überproduziert. Da Oxyluciferin in wässrigen Lösungen instabil ist, müsste man gerade dort erwarten, LRE in größeren Mengen vorzufinden. Außerdem kann das reaktive 2C6HB nicht nur mit Cystein, sondern auch mit anderen Metaboliten reagieren. Es ist ferner nicht klar, woher beispielsweise das D-Cystein stammt und wie zwischen L-Cystein und D-Cystein diskriminiert werden könnte. So kann zwar die Luciferase L-Luciferin als Substrat verwenden, dieses hemmt aber die Lichtreaktion.^[12] Außerdem konnte man noch nicht das Enzym verifizieren, das die Racemisierung katalysiert. Es ist nicht einmal sicher, wie die Käfer (oder Symbionten) Benzothiazolene herstellen können.

[Bearbeiten] Tetrapyrrol, das Luciferin von Dinoflagellaten

Das Luciferin aus Dinoflagellaten.

Das Luciferin in dieser Gruppe entspricht dem chemischen Grundbau eines linearen Tetrapyrrols und findet sich bei Dinoflagellaten und bei Euphausiidae. Biolumineszenz im Ozean geht größtenteils auf diese einzelligen Algen zurück, welche früher fälschlicherweise als Phosphoreszenz bezeichnet wurde. Für die Lichtemission sind neben dem Luciferin und einer korrespondieren, ca. 137 kDa großen Luciferase (LCF) auch ein sogenanntes Luciferin-Bindeprotein (luciferin-binding protein (LBP)) notwendig.^[13][14] Das Luciferin dieser Familie ist extrem instabil bei niedrigen pH-Werten, hohen Salz- und Sauerstoffkonzentrationen. Es konnte gezeigt werden, dass das LBD bei pH 8,0 an das Tetrapyrrol-Luciferin bindet, nicht aber bei pH 6,3.^[15] Dadurch soll das Substrat bis zur Reaktion geschützt werden, die am besten bei pH 6,3 abläuft, zumal die Luciferase im leicht alkalischem Mileu (pH 8.0) inaktiv ist ^[16] Die Reaktion selbst findet dabei in speziellenn Organellen statt, den sogenannten scintillons.^[17] Das Licht, das bei dieser Reaktion entsteht, erscheint blau-grünlich (Emissionsmaximum von bei ca. λ_max = 470 nm).

Es ist heute noch nicht geklärt, ob sich das Luciferin wegen seiner Verwandtschaft zu Chlorophyll a aus diesem ableitet oder erst aus mehreren Aminosäuren (Glycinen und Glutaminsäuren) schrittweise aufgebaut werden muss.^[18] Außerdem ist es paradox, dass das bei der Lichtreaktion entsehende oxy-Luciferin kein Fluorophor ist.^[19]

Biolumineszenzreaktion von Dinoflagellat-Luciferin. Bei der sog. „Lichtreaktion“ (unten) wird nach Oxidation Licht freigesetzt (λ_max ≈ 470 nm). Durch Autooxidation kann jedoch auch ohne Luciferase eine sogenannte „Dunkelreaktion“ (oben) ablaufen, bei der kein Lichtquant emittiert wird.^[19]

[Bearbeiten] Flavin, ein bakterielles Luciferin

Bakterielles Luciferin, ein reduziertes Flavinmononukleotid (Riboflavin-5-phosphat).

Bakterielle Luciferasen nutzen reduzierte Flavinmononukleotide (FMNH₂, was auch als Riboflavin-5-phosphat bezeichnet wird). FMNH₂ ähnelt einem anderen Flavin, dem FADH₂. Für die Lichtreaktion wird neben FMNH₂ und molekularem Sauerstoff auch ein langkettiges Aldehyde benötigt. Es wird angenommen, dass hierfür Tetradekanal umgesetzt wird. Bei der durch die Flavin-abhängige Monooxygenase katalysierte Reaktion wird dabei blau-grünes Licht emittiert, dass ein Emissionsmaximum bei ca. λ_max = 490 nm hat.

Alle Proteine, die etwas mit der Biolumineszenzreaktion zu tun haben, werden durch sogenannte lux-Gene kodiert (lat. lux Licht).

Das FMNH₂ wird durch eine Riboflavinkinase unter ATP-Verbrauch aus Riboflavin (Vitamin B2) gewonnen. Nach Reaktion wird FMNH₂ aus FMN regeneriert, was eine Flavinreduktase^[20] unter NADPH-Verbrauch kataylisert. Auch das langkettige Aldehyd wird aus der bei der Reaktion entstandenen Fettsäure zurückgewonnen, was im sogenannten Fettsäure-Reduktase-Komplex^[21] unter Verbrauch von ATP und NADPH katalysiert wird. Die Biolumineszenzreaktion verbraucht viel Energie, da für die Regenerierung der Komponenten bereits zwei Moleküle NADPH und ein Molekül ATP benötigt werden. Infolgedessen muss diese Lichtreaktion gut kontrolliert werden.

Umsetzung von bakteriellem Luziferin unter Verbrauch von Tetradecanal, einem langkettigen Aldehyd.

[Bearbeiten] Imidazolpryazin, die gemeinsame chemische Komponente des Coelentrazins und des Vargulins

Strukturformel von Coelenterazin^[22]

1962 wurde das Photoprotein Aequorin aus Aequorea victoria isoliert und dabei 1974 Coelenterazin als das Luciferin identifiziert.^[23][24] Dieses Imidozolpyrazin ist in vielen anderen biolumineszenten marinen Organismen vertreten, z. B. in Tintenfischen, Garnelen (Mysida), Fischen, Ruderfußkrebsen (Copepoda) sowie Zehnfußkrebse (Decapoda) und anderen Hohltieren (Cnidaria; Ctenophora), aber auch in nicht biolumineszenten Meeresbewohnern.^[25][26][27] Auch Derivate von Coelenterazin werden von zahlreichen marinen Lebewesen genutzt. So ist beispielsweise das Luciferin von Watasenia scintillans^[28] ein Disulfid.

Wie nun die biochemischen Mechanismen für das Luciferin-Luciferase-System mit Imidazolpryazinen ablaufen, wurde 2000 anhand von A. victoria gezeigt.^[29] Hierbei spielt das Aequorin eine wesentliche Rolle, bei dem bereits das Luciferin (Coelenterazin) durch eine Peroxidbrücke mit dem Proteinteil verbunden ist. Infolgedessen führt das Photoprotein bereits das oxidierende Agens mit sich. Aequorin besitzt drei Bindestellen für Calciumionen. Wenn Calciumionen daran binden, ändert sich die Konformation des Proteins derart, dass eine intramolekulare Reaktion mit dem Coelenterazin ausgelöst wird. Dieses reagiert zunächst zu einem instabilen Dioxetan, so dass nach Abspaltung von CO₂ schließlich das Anion von Coeleteramid entsteht. Nach Relaxation in den Grundzustand wird ein Lichtquant mit einer Wellenlänge von λ_max = 465 nm emittiert. Wegen dieses blauen Leuchtens wird das Protein auch als das blaufluoreszierende Protein (blue fluorescent protein) (BFP)^[30] bezeichnet. Das Photoprotein wird in Anwesenheit von Coelenterazin und molekularem Sauerstoff schließlich regeneriert.

Mechanismus der Biolumineszenz von Aequorin.

Aequorea victoria fluoresziert aber nicht blau, sondern grün. Das liegt daran, dass das blau fluoreszierende Protein die Energie der Biolumineszenzreaktion strahlungslos auf das sogenannte grün fluoreszierende Protein (GFP) überträgt.

Manche marine Meeresorganismen nutzen Luciferine, die dem Coelenterazin ähneln. Jedoch ist bei diesen gemeinsam, dass sie im Zuge der Lichtreaktion das Anion des Coeleteramids erzeugen. Bei W. scintillans katalysiert eine membrangebundene Luciferase unter Verbrauch von ATP, Magesiumionen sowie Sauerstoff die Lichreaktion, dabei werden ATP, Magesiumionen sowie Sauerstoff für die Umsetzung von Coelenterazindisulfat benötigt. Es entsteht dabei Licht zwischen 400 bis 580 nm (λ_max = 470 nm).^[31]

Das Luciferin aus Vargula hilgendorfii, auch als Vargula- bzw. Cypridina-Luciferin bekannt, besteht aus einer Tryptophan- (A), einer Arginin- (B) sowie einer Isoleucineinheit (C).

Vargulin aus Muschelkrebsen (Vargula hilgendorfii oder auch Cypridina hilgendorfii) wurde 1957 isoliert und 1966 als Imidazolpryazinkomponente identifiziert. Die Quantenausbeute liegt bei Q = 0,3. ^[32] Auch hier entsteht nach Ablauf der Lichtreaktion das Coeleteramid der Komponente. Bereits 1966 wurde vermutete, dass jenes Luciferin aus L-Arginin, L-Isoleucin und L-Tryptophan aufgebaut wird, wofür es mittlerweise immer mehr Hinweise gibt.^[33][34]

Allgemeine Umsetzung eines Celentreazins durch eine korrespondierende Luciferase zu einem Coelenteramid.

[Bearbeiten] Nicht klassische Luciferin-Luciferase-Systeme

Das bei der Süßwasserschnecke Neuseelands (Latia neritoides) vorkommende Luciferin^[35] ist ein terpenoides Aldehyd und wird als Latia-Luciferin bezeichnet.^[36][37]

Es wird katalytisch zu einem Keton (oxy-Luciferin) ungesetzt, was durch eine 173 kDa große Luciferase (EC-Nummer 1.14.99.21), ein Homohexamer, katalysiert wird.^[38] Für die Reaktion ist als Cofaktor das 39 kDa große purple protein^[36][37] aber nicht unbedingt nötig.^[38] Bei der Reaktion werden neben CO₂, H₂O und Ameisensäure auch Licht freigesetzt, dessen Emissionsmaximum bei λ_max = 536 nm liegt.^[39] Daher erscheint der Schleim der Schnecke, der z. B. nach mechanischen Reizen abgesondert wird, grün zu lumineszieren.

Das entstehende oxy-Luciferin ist aber im Gegensatz zu oxy-Luciferin des Leuchtkäfers kein Fluorophor. Es wird vermutet, dass die bei dieser Reaktion freiwerdende Energie auf den eigentlichen Emitter übertragen wird, einem proteingebundenen Flavin.^[40][38] Die Reaktionseffizienz dieser Biolumineszenzreaktion ist sehr gering, da die Quantenausbeute Q bei ca. 0,003 liegt.^[38]

Luciferinreaktion des Luciferins von Latia neritoides. Die reduzierende Komponente X sowie der eigentliche Lichtemitter der Reaktion müssen noch identifiziert werden.

Das Luciferin des Wurmes Diplocardia longa ist ein einfaches Aldehyd, das N-Isovaleryl-3-aminopropanal. Das besondere bei der Biolumineszenzreaktion ist die Tatsache, dass Wasserstoffperoxid an Stelle von molekularen Sauerstoff benötigt wird. Die korrespondierende Luciferase, eine 300 kD großes Enzym, setzt dann die aktivierte Form, ein Peroxid-Addukt, um. Die Luciferase benötigt Kupfer, es wird blau-grünes Licht emittiert. Man weiß jedoch nicht, welchen Zweck die Biolumineszenz bei Würmern generell haben kann.^[41][42] Auch hier muss der eigentliche Emittter der Biolumineszenzreaktion noch identifiziert werden.

Im Gegensatz zu den meisten Luciferinen wird das Luciferin des Wurmes Diplocardia longa mittels Wasserstoffperoxid oxidiert und dann umgesetzt.

[Bearbeiten] Anwendungen

• Diagnostik

Mit Hilfe des Luciferin-Luciferase-System aus Leuchtkäfern kann die Anwesenheit von ATP in Proben schnell überprüft werden.^[43]

Da die Lichtreaktion Aequorins von Calciumionen abhängig ist, kann durch dieses System die Konzentration an Calciumionen gemessen werden. Die erste Anwendung datiert sich auf 1967, als man mit Hilfe von Aequorins intrazelluläre Änderungen der Calciumkonzentrationen in Muskelzellen detektiert hat. Nach Klonierung von Aequorins in Bakterien konnte man die Calciumkonzentraiton bateriellen Cytosols messen.^[44] Außerdem ist es möglich, Aequorin in eukaryontische Zellen klonieren.^[45] So konnte man beispielsweise bei transgenen Pflanzen die Änderung der cytosolischen Calciumkonzentration nach Berühren der Pflanze oder nach einem Kälteschock messen.^[46]

• Gentechnik

Luciferasen werden in der Molekularbiologie oft als Marker eingesetzt: Organismen, die das Gen erhalten und in ihr Genom eingebaut haben, leuchten bei Zufuhr von Luciferin. So könnte man beispielsweise nachweisen, ob Gene, die man in Organismen einbringen möchte, auch wirklich exprimiert werden. Dafür wird einfach das zu exprmierende Gen mit dem einem Gen gekoppelt, das für eine Luciferase kodiert.

[Bearbeiten] Einzelnachweise

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2. ↑ Hastings, JW. Bioluminescence. (N. Sperelakis, ed.). In: Cell Physiology, Dritte Edition, Academic Press, NY., 1115–1131
3. ↑ Herring PJ. (1987): Systematic distribution of bioluminescence in living organisms. In: J Biolumin Chemilumin. 1(3); 147–163; PMID 3503524
4. ↑ White, EH. et al. (1971): The chemi- and bioluminescence of firefly luciferin: an efficient chemical production of electronically excited states. In: Bioorg. Chem. 1(1-2); 92–122; doi:10.1016/0045-2068(71)90009-5
5. ↑ PubChem 5459882 (Firefly-Luciferin)
6. ↑ NiceZyme View of ENZYME: EC 1.13.12.7
7. ↑ Keller, GA. et al. (1987): Firefly luciferase is targeted to peroxisomes in mammalian cells. In: Proc Natl Acad Sci USA. 84(10): 3264–3268; PMID 3554235; PDF (freier Volltextzugriff, engl.)
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45. ↑ Kendall, JM et al. (1992): Targeting aequorin to the endoplasmic reticulum of living cells. In: Biochem Biophys Res Commun. 189(2); 1008–1016; PMID 1472014
46. ↑ Knight, MR. et al. (1991): Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. In: Nature 352(6335); 524–526; PMID 1865907

[Bearbeiten] Literatur

• Osamu Shimomura: Bioluminescence: Chemical Principles and Methods. Word Scientific Publishing Company 2006; ISBN 9-81256801-8
• T. Wilson and JW. Hastings (1998): Bioluminscence. In: Annu. Rev. Cell Dev. 14; 197–230; PMID 9891783
• Greer III., LF. und Szalay, AA. (2002): Imaging of light emission from the expression of luciferases in living cells and organisms: a review. In: Luminescence 17, 43–74; PMID 11816060 doi:10.1002/bio.676
• K. Teranishi (2007): Luminescence of imidazo[1,2-a]pyrazin-3(7H)-one compounds. In: Bioorg Chem. 35(1); 82–111; PMID 17007903

[Bearbeiten] Weblinks

• Luciferin-Luciferase Systeme (engl.)
• Lumineszenz von Käfern
• The Biochemistry and Molecular Biology of Bacterial Bioluminescence (engl.)

[Bearbeiten] Siehe auch

• Luciferasen
• Biolumineszenz