Полимеразын гинжин урвал
Чөлөөт нэвтэрхий толь, Википедиагаас
- "ПГУ" нь энэ хуудсанд шууд холбогджээ. Өөр утгуудыг үзэхийг хүсвэл, ПГУ (салаа утга)-г үзнэ үү.
Полимеразын гинжин урвал (ПГУ) нь молекул биологид өргөн хэрэглэгддэг шинжилгээний арга юм. Үүний нэр нь ДНХ полимераз гэдэгээс гаралтай. ДНХ полимеразаар ДНХ-ын өчүүхэн хэсгийг хиймэл орчинд буюу (инвитрод) ферментийн репликац ашиглан олшруулдаг (ампликац). Полимеразын гинжин урвал явагдахад өөрөө өөрийгөө үүсгэсэн ДНХ нь олшруулалтанд хэрэглэгдэх загвар болдог. Улмаар ДНХ-ын загвар экспоненциалаар олшрох гинжин урвал хөдөлгөөнд орж эхэлдэг. ПГУ-ын тусламжтай ДНХ-ийн өчүүхэн хэсгийн ганц эсвэл цөөн хуулбарыг олшруулж хэдэн сая болон түүнээс дээш ДНХ-ийн хэсгийг гарган авах боломжтой. ПГУ-ыг ДНХ-ын хэлбэрийг өөрчлөхгүйгээр гүйцэтгэх мөн боломжтой бөгөөд үүнийг өргөжүүлэн хөгжүүлж генетикийн инженерчлэлийн өргөн талбарт хэрэглэж болдог.
Бараг бүх ПГУ-ын арга нь дулаанд тогтвортой ДНХ полимеразыг ашигладаг. Тухайлбал Термус акуатикус бактериас гаргаж авсан фермент болох Таку полимеразыг ашигладаг. Энэхүү ДНХ-ийн полимераз нь дан хэлхээт ДНХ-г загвар болгон ашиглаж ДНХ-г бүрэлдүүлэгч нэгж болох нуклеотидуудаас шинэ ДНХ-ийн хэлхээг ферментлэх замаар бүрэлдүүлдэг бөгөөд үүнд ДНХ-ийн олигонуклеотидуудыг (мөн ДНХ праймерууд ч гэж нэрлэдэг) ДНХ-ийн нийлэгжилтийг эхлүүлхэд хэрэглэдэг. ПГУ-ын аргуудын ихэнх нь термал циклерийг ашигладаг бөгөөд энэ төхөөрөмж нь ПГУ-ын дээжийг тодорхой температурын шатлалуудын дагуу явуулах үүднээс ээлжлэн халааж, хөргөх процессыг явуулдаг. Эдгээр өөр өөр температурын шатлалууд нь ДНХ-ийн хос спиралын хэлхээг задлахад (ДНХ хайлалт) шаардлагатай бөгөөд ДНХ полимеразыг ашиглан ДНХ-ийн нийлэгжилтийг эхлүүлж бай ДНХ-г сонгон олшруулах боломжыг олгодог. ПГУ-ын хүчин чадал болон сонголт нь гол төлөв праймеруудыг хэрхэн сонгохоос хамаардаг ба праймерууд нь олшруулахаар сонгосон ДНХ-ийн муж болон ашиглах термо циклийн горимоосоо маш ихээр хамаардаг.
[Засварлах] ПГУ-ын зарчим болон ажиллах горим
Полимеразын гинжин урвалыг ДНХ-ийн хэлхээний тодорхой хэсгийг (бай ДНХ) олшруулахад ашигладаг. Тэр тодорхой хэсэг нь дан ганц гени, генийн хэсэг, эсвэл кодлогдоогүй дараалал байж болно. Ихэнх ПГУ-ын аргуудын нийтлэг тал нь дээд тал нь 10 кило хос суурь (кс) хүртэл урттай хэрчимүүдийг олшруулдаг. Гэвч зарим аргууд нь 40 кс хэмжээтэй хэрчимүүдийг олшруулах боломжтой байдаг.[1]
Үндсэн ПГУ-ыг тавихад хэд хэдэн найрлага болон урвалж шаардлагатай болдог.[2] Эдгээр найрлагуудыг дурдвал:
- Олшруулахаар төлөвлөсөн ДНХ-ийн хэсгийг агуулсан ДНХ-ийн загвар.
- ДНХ-ийн мужын 5' (таван праймын) болон 3' (гурван праймын) төгсгөлүүд дээрх ДНХ-ын хэсгийг нөхдөг нэг болон эсвэл хэд хэдэн праймерууд.
- ДНХ полимераз тухайлбал Таку полимераз эсвэл 70°C орчимд тохиромжтой өөр ДНХ-ийн полимераз.
- Дезоксирибонуклеотид трифосфат (дНТФ) нь тулгуур өрөгч буюу эдгээрээс ДНХ-ийн полимеразаар шинэ ДНХ хэлхээг нийлэгжүүлдэг.
[Засварлах] Ажиллах зарчим
ПГУ нь гол төлөв 20-оос 35 хүртэл давтагдах температурын өөрчлөлтүүдийн цувралаас бүрдэнэ. Эдгээр өөрчлөлтүүдийг мөчлөг буюу цикл гэдэг. Мөчлөг бүр нь 2-3 удаагийн тасралттай (дискрет) температуруудын шатлалаас бүрддэг. Хамгийн түгээмэл ПГУ нь температурын гурван шатлалтай мөчлөгүүдээр явагддаг (Зураг 2). Мөчлөг бүр нь ихэвчлэн өндөрт хэмд (>90°C) температурын нэг шатлалаар эхлэх бөгөөд үүнийг барилт гэдэг. Улмаар эцсийн бүтээгдхүүний өргөтгөл эсвэл түр хадгалалтын төгсгөлд дахин нэг барилт явагддаг. Мөчлөг бүрд ашиглагдах температурын хэмжээ болон тухайн температурт барих хугацаа зэрэг нь олон хүчин зүйлсээс хамаардаг. Эдгээрт ДНХ-ийн нийлэгжилтэнд хэрэглэгдэх фермент, урвал дахь дНТФ (дезоксирибонуклеотид трифосфат) болон хоёр валентын ионуудын найрлага, мөн праймеруудын хайлах температур (Tm) зэрэг нь ордог.[3]
- Эхлэх шатлал: Энэ шатлалд урвалыг 94-96°C (хэрэв дулаанд маш тогтвортой полимераз хэрэглэгдэж буй үед 98°C хүртэл) температурт хүртэл халаана. Энэ температурт 1-9 минут орчим барьдаг. Энэ нь зөвхөн халуун эхлүүлэлттэй ПГУ-аар (ХЭ ПГУ) тавигддаг дулааны идэвхжүүлэлт шаарддаг ДНХ полимеразуудад ашиглагддаг.[4]
[Засварлах] Ишлэл
- ↑ Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R (1994). "Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA". Proc Natl Acad Sci. 91: 5695-5699. PMID 8202550.
- ↑ Joseph Sambrook and David W. Russel (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 0-87969-576-5. Chapter 8: In vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction
- ↑ Rychlik W, Spencer WJ, Rhoads RE (1990). "Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro". Nucl Acids Res 18: 6409-6412.
- ↑ D.J. Sharkey, E.R. Scalice, K.G. Christy Jr., S.M. Atwood, and J.L. Daiss (1994). "Antibodies as Thermolabile Switches: High Temperature Triggering for the Polymerase Chain Reaction". Bio/Technology 12: 506-509.
