Полимеразна верижна реакция

от Уикипедия, свободната енциклопедия

Полимеразната верижна реакция (Polymerase Chain Reacton, PCR) е експериментален метод от молекулярната биология и молекулната диагностика. Реакцията е открита от Кари Мулинс. Тя се състои от няколко стъпки, след които броят на началните ДНК молекули е увеличен. Това е необходимо, когато няма на разположение достатъчно ДНК за експерименти и анализ.

Методът се състои в ин витро ензимно намножаване (амплификация) на избрани нуклеотидни последователности, ограничени от известни секвенции.

[редактиране] Компоненти

Във всяка амплификационна реакция участват:

• ДНК — матрица за осъществявания процес, получена след топлинна денатурация на специфична ДНК.
• Таq-полимераза — осъществява процеса на копиране на желаната ДНК последователност. За първи път е изолирана от микроорганизма Termophylus aquaticus. Ензимът Taq-полимераза е термостабилен и запазва своята активност от 45 до 60 минути при 94°С — т.е. през целия амплификационен процес. Оптималната температура за синтез с Taq-полимеразата е 72°С.
• Праймери (зародиши) — представляват къси синтетични олигонуклеотиди (14—40 нуклеотида), комплементарни на ограничаващите намножаваната последователност участъци. От тях започва синтеза на ДНК при всеки нов цикъл на PCR-реакцията. Оптималната концентрация на праймерите в амплификационната реакция е 0,1 — 1,0 μМ.
• Дезоксирибонуклеотидтрифосфати — дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ — Служат като субстрат за изграждане на новосинтезиращата се верига, като се включват избирателно на принципа на комплементарност. Задължително условие е четирите типа дНТФ да присъстват в еквимоларни количества в реакционната смес. Оптималната концентрация е 20 до 200 μМ за всеки нуклеотид.
• Реакционен буфер — осигурява подходящото pH=8,3 — 9,0 на средата и необходимите йони за работа на ензима. Включва в състава си 10-50 mМ Tris-HCl с рН=8,3-9,0 ; до 50mM KCl и 0,5-5,0 mM MgCl₂. Освен това, може да съдържа и желатин, говежди серумен албумин (BSA), нейонни детергенти (като DMSO — диметил сулфооксид) и други. Компонентите на буфера могат да варират качествено и количествено, в зависимост от изискванията на конкретната Taq-полимераза.

[редактиране] Етапи

Полимеразната верижна реакция започва с първоначална продължителна денатурация, която цели разделяне на двойната верига на ДНК. Амплифицирането на желания участък се осъществява при условия на многократно повтаряне на серия от цикли с определена температура, всеки от които включва следните три стъпки:

1. Термична денатурация (denaturation)

   При 90 до 97°С се осигурява пълно разделяне на двойноверижната ДНК до едноверижни матрици за амплификация;

2. Хибридизация (annealing)

   Осъществява се между праймерите и комплементарните им участъци от матричната едноверижна ДНК. Температурата на това взаимодействие е строго специфична и се изчислява в зависимост от базовия състав и дължината на използваните праймерни секвенции. Емпирично тя може да бъде изчислена по следната формула:

   tC_annealing = (A+T)x2+(G+C)x4-5C

3. Синтез (extension)

   Синтезиране на нова, комплементарна на матричната ДНК-верига е в посока 5→3. Температурата на този етап се определя от особеностите на използвания ензим и осигурява най-високата активност на ДНК-полимеразата. Обикновено температурата е около 72°С.

• Крайна фаза

Обикновено след последният цикъл температурата се задържа на 72°C от 5 до 15 мин. Това се прави с цел завършване на частично елонгираните продукти. След PCR епруветките се съхраняват при -20°С.