웨스턴 블랏
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웨스턴 블랏(Western blot)이란 특정 단백질의 유무 또는 양을 알기 위해 수행하는 분석방법이다. 주로 단백질의 발현 여부를 알기 위해 사용한다. 서던블랏(southern bolt)과 노던블랏(northern blot)이 DNA-DNA, DNA-RNA간의 특이성을 이용하는데 반해 웨스턴 블랏은 단백질-단백질간의 특이성을 이용한다. 주로 항원-항체(Antigen-Antibody)반응을 이용한다.
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[편집] 특징
항원-항체(Antigen-Antibody)반응을 이용하기 때문에 매우 높은 특이성을 지닌다.
[편집] 방법
[편집] 젤 만들기
젤은 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 젤에 SDS를 넣은 것을 사용한다. Polyacrylamide, SDS, Ammonium persulfate, TEMED 를 틀에 넣어 굳혀서 젤을 만든다. 굳히는데 30분정도 기다린다.
[편집] 단백질 준비
단백질은 5분간 90도에서 denaturation시킨다.
[편집] 단백질 전기영동
장치에 loading buffer를 채운다.(2 X SDS gel loading buffer 100 mM Tris ph 6.8 200 mM DTT 4% SDS 0.2% bromophenol blue 20% glycerol)
단백질은 5분간 90도에서 denaturation시킨다.
단백질을 loading하기 전 well을 씻어준다.
단백질을 loaging한다.
혼합단백질을 SDS-PAGE에 전기영동한다.(100mA, 단백질이 젤의 끝까지 내려올 때까지)
전기영동이 끝난 후 젤을 Transfer buffer에 넣는다.
단백질 분리에 영향을 주는 요소는 단백질의 모양, 질량당 charge이지만, SDS-PAGE를 이용하면 단백질의 크기에 의해서만 분리가 되는 장점이 있다. SDS는 끝에 sulfate가 붙어 있어 음전하를 띤다. SDS를 단백질에 넣으면 단백질 크기에 따라 더 많은 SDS가 결합하여 단백질은 전체적으로 음전하를 띠게 된다. 단백질에 의한 전하보다 SDS에 의한 전하가 더 크기 때문에 모든 단백질이 음전하를 띠게 되고 모든 단백질은 양극으로 이동하게 된다(단백질의 음전하가 너무 커서 고유의 전하는 영향을 미치지 않음). 또한 SDS에 의해 단백질 구조에 변성을 가져오므로 단백질 구조에 의한 차이가 상쇄된다. 따라서 젤의 그물구조에서 크기(분자량)에 의해 작은 크기의 단백질은 빠르게, 큰 단백질은 느리게 이동하게 된다.
[편집] 단백질 transfer
Transfer는 단백질을 나일론 막으로 옮기는 작업이다.
whatman filter paper를 젤크기에 맟추어 자른다.
나일론 membrane을 순수한 메탄올에 적신다.
몇분후, paper2장, membrane, gel, paper2장의 순서로 겹쳐 놓는다.(단백질이 아래쪽으로 이동할 것을 가정하였을 때) 판위에 Transfer buffer를 적신다.
170mA에서 90분간 Transfer한다.
Transfer를 하는 이유는 Antibody가 gel안으로 쉽게 들어가지 못하기 때문이다.
Transfer buffer에서 glycine또는 HCl의 역할은 (-)charge를 갖게 하여 전기가 흐를 수 있게 하는 것이다.
[편집] bolcking
TBS로 membrane을 15분간 2회 washing 후 1% BSA-TBST에 1~2시간 혹은 5% non fat dry milk에 30분간 담가둔다.
[편집] 1차 항체반응
TBST로 15분간 2회 washing 후 primary antibody를 1~2시간 처리한다.
1차 항체는 단백질에 직접 붙을 수 있게 디자인 된 것을 이용한다.
1.5시간 정도 반응시킨다.
[편집] 2차 항체반응
2차 항체는 눈으로 확인하기 위해 사용한다. 2시간 정도 반응시킨다.
TBST로 15분간 2회 washing 후 horseradish peroxidase가 부착된 secondary antibody를 1시간 처리하고 washing한다.
[편집] 감별
2차항체의 종류에 따라, 형광, 염색등을 이용하여 감별 할 수 있다.
membrane에 solution을 1~2분 처리 후 X-ray film에 감광한다.
