Puce à ADN
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Une puce à ADN (puce à gènes, biopuce, voir également la terminologie biochips, DNA-microarrays ou microarrays) est un ensemble de molécules d'ADN fixées sur une surface qui peut être du verre, du silicium ou bien encore du plastique. Cette biotechnologie récente permet de quantifier le niveau d'expression des gènes (transcrits) dans une cellule d'un tissu donné (foie, intestin...), à un moment donné (embryon, adulte...) et dans un état donné (malade, saine...).
Le principe de la puce à ADN repose sur la particularité de reformer spontanément la double hélice de l’acide désoxyribonucléique face au brin complémentaire. Les quatre molécules de base de l'ADN ont en effet la particularité de s'unir deux à deux par des liaisons Hydrogènes. Si un patient est porteur d'une maladie, les brins extraits de l'ARN d'un patient (et rétrotranscrits en ADN, vont s'hybrider avec les brins d'ADN synthétiques représentatifs de la maladie.[1]
- Principe
Concrètement, les ARN totaux sont extraits des cellules et subissent une amplification et qui va permettre d'obtenir une quantité de materiel génétique suffisante pour l'experience. Ensuite ces ARN sont transformés en cDNA (ADN complémentaires) par la technique de reverse transcription. Lors de cette étape, seuls les ARN messagers seront transformés en cDNA. Enfin ils sont transformés au cours d'une dernière étape en cRNA (ARN complémentaires) et marqués par deux colorants appelés Cyanine 3 (Verte) et Cyanine 5 (Rouge).
Par exemple on peut marquer l'ADN complémentaire du malade en Vert et du traité en rouge ou bien, du témoin en rouge et du traité en vert.Ce marquage se fait habituellement grâce à une enzyme: la polymérase T7 qui amplifie l'ARNm et incorpore les cyanines pour un marquage optimal. Une fois marqués ces ARN complémentaires sont déposés sur la lame de verre qui, elle-même, possède fixée à sa surface, des fragments de génome humain recouvrant tous les gènes présents dans une cellule.
Les molécules d'ADN fixées sur la lame sont appelées des sondes même si la nomenclature peut varier. Des milliers de sondes peuvent être fixés sur une même puce. Actuellement, les puces les plus performantes peuvent accueillir jusqu’à 4 x 44 kilobases d'ADN soit l'équivalent de 4 génomes humains complets sur UNE puce !!! Cela permet de tester différentes cultures cellulaires sur une même lame voire de faire des réplicats (ce qui est vivement recommandé pour l'analyse biostatistique en aval). Cette technologie provient d'une adaptation du Northern Blot où de l'ADN fragmenté est fixé à un support puis hybridé avec un ARN complémentaire. La mesure de l'expression de gènes par puce à ADN s'applique à de nombreux domaines de la biologie et de la médecine comme l'étude de traitements, de maladies ou bien encore de stades développementaux.
- À quoi est-ce que ça peut servir ?
La comparaison de deux expériences de puce à ADN sur deux cellules du même type l'une saine et l'autre malade peut permettre de découvrir des gènes exprimés uniquement dans la cellule saine (ou uniquement dans la cellule malade): de fait, en UNE seule expérience, on est capable de connaître les gènes qui sont modifiés par une molécule. Connaissant ces gènes, on peut alors doser leur expression en PCR quantitative. En effet, les puces apportent principalement des données qualitatives (expression ou non d'un gène) mais il est difficile de quantifier l'expression d'un gène avec la technologie des puces à ADN. L'utilisation des puces à ADN connaît un essor croissant notamment dans le domaine de la cancérologie pour le typage tumoral d'après leur profil génétique. L'utilisation des puces à ADN comme outil diagnostique présente l'avantage de faire appel à de nombreux marqueurs : plusieurs milliers de gènes peuvent être criblés simultanément pour fournir une signature du type cellaire étudié. Si l'on considère que chaque type de tumeur présente une signature génétique "unique", ce système permet virtuellement de distinguer et classer tous les types de tumeurs.
Sommaire |
[modifier] Fabrication
La puce est une plaque de petite taille environ 6 cm X 3 cm sur laquelle sont fixés des brins monocaténaires (un seul brin au lieu des deux habituels) d'ADN, chacun correspondant au brin complémentaire d'un ARN messager (ARNm). On peut fixer sur cette plaque plusieurs dizaines de milliers de fragments d'ADN (et donc étudier l'expression d'autant de gènes).
Pour la technologie Agilent, le dépot des sondes sur la lame se fait par la technologie "INKJET" De cette manière, des robots spotteurs déposent des goutelettes infimes par rangées (d'où le terme ARRAY)
Les ARNm (provenant des gènes exprimés) sont extraits de la cellule à analyser et des fluorochromes sont fixés sur les bases. Puis le mélange témoin marqué et traité marqué est versé sur la puce: chaque brin d'ADNc va s'hybrider au brin monocaténaire d'ADN qui lui est complémentaire pour former un double brin. La plaque est ensuite lavée par des bains spécifiques pour éliminer les brins d'ADNc ne s'étant pas hybridés car non complémentaires de ceux fixés sur la lame.
Elle est ensuite scannée au laser et une image de la puce est créée : chaque fois qu'il y a eu hybridation, le fluorochrome fixé sur l'ARNm a émis dans la longueur d'onde du laser et cela est visible par un point de couleur (rouge pour des fluorochrome émettant dans le rouge...) Les puces à ADN peuvent être fabriquées par des techniques diverses qui incluent l'impression sur des plaques de verre à l'aide de pointes, la photolithographie à l'aide de caches, de micro-miroirs, d'impression par jet d'encre, d'électrochimie sur des puces microélectroniques.
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Création d'une puce (info) Création d'une Puce à ADN par un robot à l'Université du Delaware (États-Unis) Un problème pour lire la vidéo ? Voir l’aide.
Les puces à ADN peuvent être utilisées pour détecter les ARN qui seront ou pas traduits en protéines. Les scientifiques parlent d'analyse d'expression ou de profil d'expression. Puisque des dizaines de milliers de sondes sont fixées sur une puce, chaque hybridation sur une puce renseigne autant qu'un nombre équivalent de tests de génétique quantitative. Les puces à ADN constituent ainsi une approche massive et ont contribué à la révolution de la génomique[2]. Le premier profil d'expression par puce à ADN a été publié en 1995 dans le magazine américain Science. Le premier génome eucaryote fixé sur une puce fut celui de la levure (Saccharomyces cerevisiae); ce profil d'expression a été publié en 1997 dans la revue Science.
[modifier] Image d'une hybridation sur une puce à ADN
Rappel : la puce à ADN contient les sondes ADN (oligonucléotides ou ADNc) fixées sur le support.
- Marquage des ADNc
Grâce à des fluorochromes, marqueurs d'ADN qui fluorescent sous un laser, on peut marquer des ADNc provenant de la rétrotranscription d'ARNm. En pratique, deux lots d'ADNc correspondant à deux traitements différents (par exemple, lot 1 en vert : ADNc de plantes témoins non traitées; lot 2 en rouge : ADNc de plantes inoculées avec un agent pathogène) sont colorés par deux fluorochromes différents. Ces deux lots sont ensuite mélangés puis hybridés sur la puce à ADN.
- Spécificité de l'hybridation
Suivant la stringence de la solution destinée à laver la puce, l'hybridation entre les lots d'ADNc et les sondes sera plus ou moins spécifique.
- Comment les analyse-t-on ?
Des logiciels interprètent la luminosité de chaque point de la plaque contenant un ADN différent et en déduisent une mesure numérique de l'expression de chaque gène. Si le lot d'ADNc n°1 (plantes non traitées) est marquée en vert et que le lot d'ADNc n°2 (plantes traitées) est marquée en rouge alors : - Les gènes dont l'expression est augmentée suite au traitement apparaissent alors en rouge et peu en vert sous un laser. - Les gènes peu affectés par le traitement apparaissent en vert - Les gènes dont l'expression est forte dans les deux conditions apparaissent en jaune - Les gènes peu exprimées n'apparaissent pas.
- Et aussi...
Il existe deux grandes familles de puces à ADN, l'une ne pouvant recevoir qu'un échantillon de cellule par plaque (mais pouvant contenir beaucoup plus de gènes fixés sur la plaque) et l'autre pouvant recevoir deux échantillons différents, chacun labélisé avec un fluorochrome de couleur différente : sur l'image, un point vert sera donc un gène exprimé dans la cellule saine tandis qu'un point rouge sera un gène exprimé dans la cellule malade. Un point jaune est exprimé dans les deux cellules et un point noir dans aucune...
Il existe aussi de très récentes puces à protéines qui permettent d'étudier le protéome d'une cellule donnée. Ce sont cette fois des antigènes qui sont fixés sur la plaque.
[modifier] Références
[modifier] Voir aussi
[modifier] Liens externes
- [pdf] Julien Tap Mise au point d’une puce à ADN pour le typage et l’étude de la biodiversité de Listéria(2005)
Site de l'Institut de physiopathologie Humaine de Marseille - IFR 125: http://www.ifr125.fr
Site d'Innobiochips avec de nombreux schémas et explications sur les biopuces : http://www.innobiochips.fr
