Sekwencjonowanie DNA
Z Wikipedii
A. – przykładowa sekwencja DNA
B. – przyłączenie startowego oligonukleotydu do nici matrycowej i kierunek syntezy DNA
C. - produkty syntezy DNA, zakończone fluorescencyjnie znakowanymi dideoksynukleotydami (kolorowe litery)
D. – Chromatogram rozdziału fragmentów w elektroforezie kapilarnej.
Sekwencjonowanie DNA - technika odczytywania sekwencji czyli kolejności par nukleotydowych, w cząsteczce DNA.
Sekwencjonowanie dokonuje się przy pomocy zautomatyzowanych sekwencjonerów. Manualne sekwencjonowanie stosuje się przy opracowywaniu nowatorskich metod, w niektórych laboratoriach dla krótkich fragmentów, lub podczas ćwiczeń[potrzebne źródło].
GACACCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGG
Spis treści |
[edytuj] Metody historyczne
Historyczną już i wypieraną metodą jest opracowana w 1975 r metoda Sangera, oparta o syntezę DNA przez polimerazę DNA in vitro. Do reakcji dodaje się niewielką ilość trifosforanów dideoksynukleotydów (ddNTP), które są wbudowywane w DNA, ale ich dołączenie uniemożliwia dalsze wydłużanie nici. W ten sposób otrzymuje się fragmenty DNA o różnej długości zakończone specyficznym nukleotydem. Produkty reakcji rozdziela się elektroforetycznie, co powoduję ich segregację pod względem wielkości.
[edytuj] Metody współczesne
Obecnie metoda odczytu została zautomatyzowana dzięki wykorzystaniu znakowanych fluorescencyjnie tirfosforanów dideoksynukleotydów i pozwala na odczyt 300-1000 par zasad z jednej kapilary lub linii na żelu[potrzebne źródło].
Autorem alternatywnej metody sekwencjonowania DNA, z wykorzystaniem specyficznej, chemicznej degradacji DNA, byli Walter Gilbert i Allan Maxam (metoda Maxama-Gilberta)[1]. Gilbert wraz z Frederickiem Sangerem otrzymali za to osiągnięcie nagrodę Nobla. Metoda Maxama-Gilberta obecnie jest rzadko stosowana.
Nowoczesne masowo równoległe aparaty do sekwencjonowania DNA są w stanie pracować z szybkością rzędu milionów par zasad na godzinę[potrzebne źródło]. DNA tranzystory polowe umożliwiają użycie natywnego DNA w hybrydyzacji do mikromacierzy i odczyt w czasie rzeczywistym.
Nagroda X prize w wysokości 10 mln dolarów czeka na ośrodek, który będzie w stanie zsekwencjonować 100 genomów ludzkich w ciągu 10 dni[2]. Pierwsze sekwencjonowanie genomu człowieka zajęło wiele lat (zob. Projekt poznania ludzkiego genomu).
[edytuj] Metody rozwojowe
- PCR
- Metodą bąbelkową + pyrosekwencjonowanie
- 454 sequencing pozwala 300 MBp na dzień w jednej maszynie [1]. Metoda ta jest szczególnie przydatna do sekwencjonowania aDNA.
- bezpośredniego odczytu[potrzebne źródło]:
- nanosekwencjonowanie. Przesuwająca się cząsteczka DNA poprzez centrum aktywne modyfikowanych polimeraz jest odczytywana bezpośrednio. Szybkość takiego odczytu może dochodzić od 300 Bp/s dla pojedynczego nanometrowego czujnika[3].
- mikroskopowe
[edytuj] Historia rozwoju metod sekwencjonowania DNA
- 1953 - opracowanie modelu podwójnej helisy DNA przez Jamesa Watsona i Francisa Cricka
- 1972 - opracowanie sposobów izolacji materiału do dalszych badań. Rozwój technologii rekombinacji umożliwiający izolację dowolnych fragmentów DNA i ich replikację.
- 1977 - Allan Maxam i Walter Gilbert ogłaszają publikację pt.: Sekwencjonowanie DNA przez chemiczną degradację. W tym samym czasie Sanger opublikował też metodę sekwencjonowania DNA przez syntezę katalizowaną enzymatycznie.
- 1980 - Fred Sanger i Walter Gilbert otrzymali Nagrodę Nobla.
- 1982 - utworzono Genbank - publicznie dostępną bazę danych sekwencji DNA
- Andre Marion i Samuel Eletr utworzyli firmę Applied Biosystems, która w tym okresie zdominowała automatyczne sekwencjonowanie DNA
- 1982 - Akiyoshi Wada zbudował roboty sekwencyjne dla firmy Hitachi.
- 1984 - badacze z MRC odczytali kompletną sekwencję wirusa Epstein-Barr, 170 kb.
- 1997 - zsekwencjonowano 5Mb genom bakterii Escherichia coli.
- 2001, 15 lutego - Konsorcjum HUGO opublikowało sekwencję genomu ludzkiego w Nature.
- 2001, 16 lutego - firma Celera Genomics opublikowała sekwencję genomu ludzkiego w Science.
